วัตถุประสงค์ของบทเรียน
เพื่อให้นักศึกษาได้รู้จักวิธีการคัดเลือกตัวอ่อนไก่เพื่อเพาะเชื้อไวรัส
อุปกรณ์และวัสดุ
ตัวอ่อนไก่ ระยะฟักตัว 9-12 วัน ไข่ตก สำลีแอลกอฮอล์ ที่วางเอ็มบริโอ แหนบ กรรไกร เทปกาว เข็ม กระบอกฉีดยา ดินสอ เข็มเจาะ เข็ม ตาราง แผนภาพ อุปกรณ์มัลติมีเดีย การนำเสนอผลงาน เอ็มเอส ออฟฟิศ พาวเวอร์พอยต์ในหัวข้อของบทเรียน
ระเบียบวิธีในการดำเนินบทเรียนและแนวปฏิบัติในหัวข้อ
คำอธิบายของครู
การเพาะไวรัสบนเอ็มบริโอไก่เป็นวิธีการที่เข้าถึงได้และสะดวกที่สุดในการแยกไวรัสเบื้องต้น การฝึกฝนการใช้วิธีติดเชื้อนี้แสดงให้เห็นข้อดีมากกว่าวิธีอื่นๆ หลายประการ สำหรับการติดเชื้อจะใช้ตัวอ่อนระยะฟักตัว 5-12 วัน
ข้อดีและข้อเสียของเอ็มบริโอไก่ในฐานะวัตถุทางชีวภาพ
การเพาะเลี้ยงไวรัสในเอ็มบริโอไก่เป็นวิธีการที่เข้าถึงได้และสะดวกที่สุด ทั้งในการแยกไวรัสเบื้องต้นจากสัตว์ป่วยและจากสิ่งแวดล้อม และเพื่อการเพาะเลี้ยงไวรัสในห้องปฏิบัติการในภายหลัง วิธีการนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการระบุไวรัสและแอนติบอดี เช่นเดียวกับการเตรียมวัคซีนและการวินิจฉัย การปฏิบัติได้แสดงให้เห็นข้อดีหลายประการของวิธีนี้มากกว่าการเพาะเลี้ยงไวรัสในสัตว์ทดลอง เป็นที่ทราบกันว่าหนูขาวซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาทางไวรัสวิทยาสามารถติดเชื้อได้เองโดยการติดเชื้อไวรัสหลายชนิด: ectromelia, lymphocytic choriomeningitis, โรคไข้สมองอักเสบเทย์เลอร์, โรคปอดบวมจากไวรัส, ไวรัสเซนไดและอื่น ๆ ซึ่งทำให้งานซับซ้อนมากและมักจะนำไปสู่ ถึงข้อสรุปที่ผิดพลาดเมื่อประเมินผลลัพธ์ที่ได้รับ ผลลัพธ์ การเพาะเลี้ยงไวรัสในเอ็มบริโอไก่ช่วยขจัดปัญหาข้างต้นได้เป็นส่วนใหญ่ นอกจากนี้ ยังสามารถรับไวรัสจากเอ็มบริโอไก่ได้มากกว่าจากสัตว์ทดลองอีกด้วย เอ็มบริโอไก่มีความมีชีวิตและความต้านทานต่ออิทธิพลประเภทต่างๆ ได้มากขึ้น ซึ่งเป็นสิ่งที่หลีกเลี่ยงไม่ได้เมื่อนำวัสดุทดสอบไปใช้ ด้วยทักษะที่ทราบกันดีในการทำงานกับเอ็มบริโอและการปฏิบัติตามกฎของภาวะปลอดเชื้อ การตายของพวกมันจึงไม่มีนัยสำคัญ ของเสียที่ใหญ่ที่สุดของเอ็มบริโอเกิดขึ้นเมื่อนำวัสดุเข้าไปในโพรงน้ำคร่ำและถุงไข่แดง แต่ถึงแม้ในกรณีเหล่านี้จะไม่เกิน 10–15% หากตรงตามเงื่อนไขการฟักตัวที่จำเป็น
เอ็มบริโอไก่ในฐานะระบบที่มีชีวิตได้เข้าสู่การปฏิบัติด้านไวรัสวิทยาในช่วงทศวรรษที่ 30 ของศตวรรษที่ 20 การใช้งานดังกล่าวได้ขยายขอบเขตของไวรัสที่เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการ ทำให้สามารถแก้ไขปัญหาด้านไวรัสวิทยาที่กำลังเผชิญอยู่ได้สำเร็จมากขึ้น เนื่องจากตัวอ่อนไก่มีข้อได้เปรียบเหนือสัตว์ทดลองหลายประการ: 1) เปลือกและเยื่อหุ้มชั้นนอกช่วยปกป้องได้อย่างน่าเชื่อถือ เอ็มบริโอจากการติดเชื้อแบคทีเรียจากสิ่งแวดล้อมภายนอก 2) ข้อได้เปรียบที่สำคัญของตัวอ่อนก็คือความไวสูงต่อไวรัสหลายชนิดซึ่งอธิบายได้จากการพัฒนากลไกการป้องกันที่ไม่เพียงพอ 3) เอ็มบริโอไก่เป็นวัตถุที่เข้าถึงได้ง่ายเนื่องจากการพัฒนาเครือข่ายฟาร์มสัตว์ปีกและโรงเพาะฟักที่กว้างขวาง 4) เอ็มบริโอไก่มีความประหยัดและไม่ต้องการการดูแลหรือให้อาหาร
ข้อเสียเปรียบหลักคือ: 1) ไม่สามารถรับประกันความเป็นหมันของระบบสิ่งมีชีวิตนี้ได้อย่างเต็มที่เนื่องจากตัวอ่อนสามารถนำไวรัสและสารก่อโรคอื่น ๆ เข้าไปในเนื้อหาได้ (ไวรัสของโรคหลอดลมอักเสบติดเชื้อในไก่, โรคนิวคาสเซิล, ไข้หวัดใหญ่, มะเร็งเม็ดเลือดขาว, หนองในเทียมและมัยโคพลาสมา) การปรากฏตัวของพวกเขาอาจบิดเบือนผลการศึกษา 2) เอ็มบริโอไก่ไม่ไวต่อไวรัสทุกชนิด
วัตถุประสงค์ของการใช้เอ็มบริโอไก่
เอ็มบริโอไก่ถูกนำมาใช้ในไวรัสวิทยาเพื่อจุดประสงค์เดียวกันกับสัตว์ทดลองเป็นหลัก ได้แก่:
– การตรวจหาไวรัสที่ออกฤทธิ์โดยการตรวจทางชีวภาพในวัสดุทางพยาธิวิทยา
– การแยกเชื้อไวรัสเบื้องต้น ไวรัสที่ทำให้เกิดโรคในนก เช่นเดียวกับไวรัสในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมบางชนิด จะถูกแยกและเพาะเลี้ยงในเอ็มบริโอของไก่อย่างมีประสิทธิภาพ
– ดูแลรักษาไวรัสในห้องปฏิบัติการ
– การไตเตรทของไวรัส
– การสะสมของไวรัสเพื่อการวิจัยในห้องปฏิบัติการและรับวัคซีน
– เป็นวัตถุทดสอบในปฏิกิริยาการทำให้เป็นกลาง
ข้อกำหนดสำหรับเอ็มบริโอไก่
ไข่จะต้องได้มาจากฟาร์มที่ปราศจากโรคไวรัส ไข่ที่ปฏิสนธิ แม้จะมาจากไก่ที่มีสุขภาพดีทางคลินิก ก็อาจมีไวรัสหลายชนิดที่พบในนกเหล่านี้: โรคนิวคาสเซิล โรคหลอดลมอักเสบติดเชื้อ กล่องเสียงอักเสบติดเชื้อ โรคไข้สมองอักเสบ โรคไข้หวัดนก-2 โรคข้ออักเสบ ไข้ทรพิษ อาร์โบไวรัส อะดีโนไวรัส ฯลฯ การมีอยู่ของไวรัสเหล่านี้สามารถ ในด้านหนึ่ง นำไปสู่ข้อผิดพลาดในการวินิจฉัย และในทางกลับกัน ขึ้นอยู่กับปรากฏการณ์ของการรบกวน ไปสู่การปราบปรามการแพร่พันธุ์ของไวรัสที่อยู่ในตัวอย่างทดสอบ เอ็มบริโอที่ไม่มีไวรัส แต่ได้มาจากไก่ที่ติดไวรัสบางชนิดโดยไม่แสดงอาการ อาจมีความไวน้อยกว่าหรือไม่รู้สึกเลยต่อผลกระทบของไวรัสที่กำหนด เนื่องจากมีแอนติบอดีจำเพาะที่ได้รับจากแม่ที่มีไข่แดง เพื่อการแยกเชื้อไวรัสได้สำเร็จ ไก่ที่มีเอ็มบริโอถูกนำมาใช้งานจะต้องไม่ได้รับการฉีดวัคซีนป้องกันโรคที่ต้องการหาเชื้อ เปลือกไข่จะต้องไม่มีสีและสะอาด (ไม่สามารถล้างได้) อายุของตัวอ่อนจะต้องสอดคล้องกับวิธีการติดเชื้อที่เลือก
เพื่อให้แน่ใจว่าตัวอ่อนมีการพัฒนาตามปกติในไข่ที่ปฏิสนธิในช่วงระยะฟักตัวจำเป็นต้องรักษาอุณหภูมิและความชื้นไว้ การพัฒนาเอ็มบริโอสามารถทนต่อความร้อนสูงเกินไปได้แย่กว่าความเย็นมาก ดังนั้นการพังทลายของระบบทำความร้อนในระยะสั้น (ภายในไม่กี่ชั่วโมง) จึงไม่ก่อให้เกิดอันตรายมากนัก หากต้องการพักระยะยาว จำเป็นต้องให้ความร้อน
การฟักไข่จำเป็นต้องได้รับอากาศบริสุทธิ์ซึ่งเข้ามาทางช่องระบายอากาศได้ฟรี พวกเขาจะต้องเปิดอยู่เสมอ ดังที่เชื่อกันโดยทั่วไปว่าไข่หนึ่งฟองใช้ออกซิเจน 1 ลิตรต่อวัน ซึ่งไม่น่าแปลกใจหากเรานึกถึงพัฒนาการที่รวดเร็วของเอ็มบริโอในช่วง 21 วันของการฟักตัว นั่นคือเหตุผลที่ไม่ควรวางไข่ไว้ใกล้กันหรือวางซ้อนกัน เทอร์โมสตัทแบบทั่วไปไม่เหมาะสำหรับการฟักไข่ เฉพาะในกรณีที่มีความจำเป็นอย่างยิ่งเท่านั้นที่สามารถใช้เพื่อวัตถุประสงค์เหล่านี้ได้ แต่ในขณะเดียวกันก็ระบายอากาศบ่อยๆ และวางภาชนะที่มีน้ำไว้ด้านในเพื่อให้แน่ใจว่าความชื้นที่ต้องการ
ไข่ที่วางเพื่อฟักไข่จะถูกตรวจสอบหลังจากผ่านไป 3-5 วันโดยใช้โคมไฟตั้งโต๊ะพิเศษหรือมือถือ (หากไข่ไม่ได้ถูกเอาออกจากถาดฟักไข่) เพื่อเลือกไข่ที่ไม่ได้รับการผสมพันธุ์ ไข่เลฮอร์นสะดวกที่สุดสำหรับงานไวรัสวิทยา เนื่องจากมีเปลือกสีขาวบางช่วยให้มองเห็นเนื้อหาได้ดีขึ้น ไข่ที่ไม่ได้รับการผสมพันธุ์หรือมีตัวอ่อนตายจะถูกเอาออกจากตู้ฟัก สัดส่วนของไข่ที่ปฏิสนธิจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย รวมถึงช่วงเวลาของปี เช่น ในฤดูใบไม้ผลิจะสูงสุด และในฤดูหนาวจะน้อยที่สุด
ตัวอ่อนจะถูกสแกนเป็นครั้งที่สองในวันที่วางแผนจะติดเชื้อ ระยะนี้ขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัสตลอดจนเส้นทางการแพร่กระจาย บริเวณที่ติดเชื้อจะถูกทำเครื่องหมายไว้บนเปลือกด้วยดินสอธรรมดา (ไม่ใช่หมึก)
โครงสร้างของเอ็มบริโอไก่
โดยปกติแล้ว ไก่จะวางไข่ที่ปฏิสนธิโดยที่เอ็มบริโออยู่ที่ระยะบลาสตูลาหรือแกสทรูลาระยะแรก เมื่อไข่ถูกให้ความร้อนจนถึงอุณหภูมิที่ใกล้เคียงกับอุณหภูมิร่างกายของไก่ เอ็มบริโอจะมีการพัฒนาเพิ่มเติม (รูปที่ 15) ในช่วงวันที่ 5 ถึงวันที่ 12 ของการฟักตัว สามารถใช้ตัวอ่อนไก่เพื่อติดเชื้อไวรัสได้
รูปที่ 15 - แผนผังของตัวอ่อนไก่ในวันที่ 8 ของการฟักตัว: 1 – เปลือก; 2 – เมมเบรนใต้เปลือก; 3 – เยื่อหุ้มเซลล์ chorioallantoic; 4 – ช่องอัลลันโทอิก; 5 – ถุงไข่แดง; 6 – โปรตีน; 7 – ห้องอากาศ; 8 – ร่างกายของตัวอ่อน; 9 – โพรงน้ำคร่ำ
ไข่ที่มีเอ็มบริโอไก่ที่กำลังพัฒนาจะถูกปกคลุมด้านนอกด้วยเปลือกแข็งและมีรูพรุน ซึ่งเยื่อหุ้มชั้นย่อยจะติดแน่น ส่วนหลังที่ปลายทื่อของไข่จะแบ่งออกเป็นสองใบระหว่างนั้นจะมีช่องอากาศเกิดขึ้น ลำตัวของเอ็มบริโอวางตัวผิดปกติอยู่ในไข่ โดยหลังอยู่ใกล้เปลือกมากขึ้น และศีรษะหันไปทางช่องอากาศ เอ็มบริโอจะแช่อยู่ในน้ำคร่ำซึ่งอยู่เต็มช่องน้ำคร่ำและเชื่อมต่อกับไข่แดงด้วยสายสะดือ ไข่แดงยังตั้งอยู่เยื้องศูนย์กลางและสัมพันธ์กับเอ็มบริโอ ราวกับว่าอยู่อีกด้านหนึ่งของแกนตามยาว
ตรงใต้เยื่อหุ้มเปลือกจะมีโพรงอัลลันโทอิกปกคลุมถุงน้ำคร่ำและไข่แดงและในวันที่ 10-11 จะปิดที่ปลายแหลมของไข่ ในระหว่างการพัฒนา เมมเบรนอัลลานโตอิกจะหลอมรวมกับคอรีออน ทำให้เกิดเป็นเมมเบรน chorioallantoic (CAO) แผ่นเดียว ปลายแหลมของไข่คือโปรตีนที่เหลือ
การติดเชื้อในเอ็มบริโอส่วนหนึ่งหรือบางส่วนนั้นเกิดขึ้นในช่วงระยะเวลาของการพัฒนาสูงสุดเมื่อจำนวนเซลล์ที่ละเอียดอ่อนมากที่สุด
ในระหว่างขั้นตอนการฟักตัว ขนาดของโครงสร้างของตัวอ่อนจะเปลี่ยนไป ซึ่งส่วนใหญ่อธิบายได้จากวัตถุประสงค์การใช้งานและเป็นตัวกำหนดอายุที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการติดเชื้อของตัวอ่อน
ดังนั้นถุงไข่แดงซึ่งเป็นแหล่งกักเก็บสารอาหารจึงมีปริมาตรมากที่สุดในช่วงเริ่มต้นของการฟักตัว และหลังจากนั้น (หลังจากวันที่ 12) ก็จะลดลงเมื่อเอ็มบริโอพัฒนา ทำให้ถุงไข่แดงติดเชื้อตั้งแต่วันที่ 5 ถึง 7 ของการฟักตัว
ช่องน้ำคร่ำซึ่งเป็นสภาพแวดล้อมกันชนสำหรับการพัฒนาของเอ็มบริโอ ครอบคลุมไว้แล้วในวันที่ 5 ของการฟักตัว ปริมาณของเหลวโดยเฉลี่ยในช่วงกลางระยะฟักตัวคือประมาณ 1 มล.
สำหรับการติดเชื้อในช่องน้ำคร่ำจะใช้ตัวอ่อนอายุ 6-10 วัน
ช่อง allantoic ทำหน้าที่รวบรวมผลิตภัณฑ์เมตาบอลิซึมเกลือของกรดยูริกฟอสฟอรัสและสารประกอบไนโตรเจนสะสมอยู่ในนั้น ในระหว่างการเจริญเติบโตและพัฒนาการของเอ็มบริโอ ของเหลวอัลลันโทอิกจะมีสภาพเป็นกรด โพรงอัลลันโทอิกจะมีขนาดสูงสุดในวันที่ 9-12 ของการพัฒนาตัวอ่อน ดังนั้นการติดเชื้อในโพรงอัลลันโทอิกจะเกิดขึ้นในวันที่ 9-11 ของการฟักตัวเป็นหลัก
เมมเบรน chorioallantoic อุดมไปด้วยหลอดเลือด ซึ่งอยู่ติดกับพื้นผิวด้านในของเปลือกที่มีรูพรุนอย่างใกล้ชิด ซึ่งอิ่มตัวด้วยออกซิเจนและจ่ายให้กับร่างกายของตัวอ่อน โดยทำหน้าที่ของอวัยวะระบบทางเดินหายใจของตัวอ่อน CAO พัฒนาสูงสุดในวันที่ 11-13 การติดเชื้อของเยื่อหุ้ม chorioallantoic จะเกิดขึ้นในวันที่ 10-12 ของการฟักตัว
การเตรียมเอ็มบริโอไก่เพื่อการติดเชื้อ
ตัวอ่อนจะถูกส่งออกจากโรงเพาะฟักโดยไม่ถูกแช่เย็นระหว่างทาง ในห้องปฏิบัติการ ตัวอ่อนจะถูกฟักในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ 37 °C และความชื้น 60-70% ซึ่งทำได้โดยการวางภาชนะคอกว้างแบบเปิดที่มีน้ำอยู่ในเทอร์โมสตัท ช่องระบายอากาศของเทอร์โมสตัทต้องเปิดอยู่ เอ็มบริโอจะถูกวางโดยให้ช่องอากาศอยู่บนแท่นพิเศษ ขอแนะนำให้ปล่อยให้เอ็มบริโอปรับตัวเข้ากับสภาวะใหม่ภายใน 24 ชั่วโมงก่อนการติดเชื้อ และทำให้การทำงานเป็นปกติหลังความเครียดจากการขนส่ง หากห้องปฏิบัติการมีโรงเพาะฟักไข่ที่ปฏิสนธิโดยไก่ก็เหมาะสมที่จะวางไข่ภายใน 10 วัน
การเตรียมตัวอ่อนไก่เพื่อการติดเชื้อ ได้แก่ การฟักไข่และการฆ่าเชื้อเปลือก รวมถึงการเตรียมสถานที่ทำงานอย่างเหมาะสม การส่องไข่เกี่ยวข้องกับการดูไข่โดยเทียบกับแหล่งกำเนิดแสงที่สว่างเพียงพอ (การส่องไข่) ซึ่งเป็นผลมาจากเงาจากโครงสร้างภายในที่เกิดขึ้นที่ด้านที่ไม่มีแสงสว่างของเปลือก (รูปที่ 16) การส่องกล้องจะดำเนินการในห้องมืด ในเวลาเดียวกันบนเปลือกด้วยดินสอกราไฟท์จะมีการทำเครื่องหมายขอบของช่องอากาศตำแหน่งของตัวอ่อนและส่วนของโซนหลอดเลือดที่มีขนาด 0.5x0.5 ซม. เครื่องหมายเหล่านี้ใช้เป็นแนวทางในการเลือก เว็บไซต์สำหรับแนะนำเนื้อหาที่มีไวรัส ในระหว่างการส่องกล้อง จะมีการพิจารณาว่าตัวอ่อนยังมีชีวิตอยู่หรือตายไปแล้ว เอ็มบริโอที่แสดงการเคลื่อนไหวอย่างแข็งขันโดยมีเลือดไปเลี้ยงหลอดเลือดที่ดีจะถือว่ายังมีชีวิตอยู่
รูปที่ 16 - การฟักไข่ของตัวอ่อนไก่ในวันที่ 10 ของการฟักตัว มองเห็นเงา: 1 – ตัวอ่อน; 2 – ถุงไข่แดง; 3 – หลอดเลือด XAO; 4 – ห้องอากาศ; 5 – กระรอก
เอ็มบริโอไก่จะติดเชื้อภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ (ควรใส่ในกล่อง) ในกล่องพรีบ็อกซ์ เปลือกของตัวอ่อนจะได้รับการบำบัดด้วยแอลกอฮอล์เสริมไอโอดีน จากนั้นในกล่องจะถูกเช็ดอีกครั้ง และบางครั้งก็ถูกเผาด้วยเปลวไฟด้วยสำลีชุบแอลกอฮอล์
ตัวอ่อนได้รับการแก้ไขโดยใช้ส่วนรองรับพิเศษที่ติดตั้งในคิวเวทเคลือบฟันบนผ้ากอซ 3-4 ชั้นที่ชุบน้ำยาฆ่าเชื้อ
งานนี้ใช้เครื่องมือฆ่าเชื้อโดยการต้ม พวกเขาจะถูกวางไว้ในขวดแอลกอฮอล์และเผาด้วยเปลวไฟก่อนนำมาใช้ใหม่แต่ละครั้ง
สาธิต
ก) อาการทางคลินิกของโรคในสัตว์ทดลองที่ติดเชื้อ b) วิธีการฆ่าสัตว์ทดลอง c) เทคนิคการชันสูตรพลิกศพ (ดึงความสนใจของนักเรียนไปที่สถานะของอวัยวะภายใน) และวิธีการรับวัสดุที่มีไวรัส d) เทคนิคการพิมพ์สมอง e) การดำเนินการเพื่อฆ่าเชื้อในสถานที่ทำงานและศพหลังจากการชันสูตรพลิกศพสัตว์ที่ติดเชื้อ
งาน
1.ศึกษาโครงสร้างของตัวอ่อนไก่
2. ทำการส่องกล้องตัวอ่อนไก่ ตรวจสอบความมีชีวิตของมัน และทำเครื่องหมายขอบเขตของเงาของการก่อตัวตามธรรมชาติ
3. เตรียมตัวอ่อนไก่สำหรับการติดเชื้อ
งานอิสระของนักศึกษา
ก) การรับรู้หนูที่ติดเชื้อโดยนักเรียนแต่ละคนด้วยเครื่องหมายสี การวิเคราะห์อาการทางคลินิก การฆ่า การตรึงในคิวเวตต์ที่มีก้นแว็กซ์ (พาราฟิน) การผ่า b) การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา การได้รับวัสดุที่มีไวรัส (อวัยวะในเนื้อเยื่อ) การเตรียมการพิมพ์สมองทีละชั้น
นักเรียนทำการส่องกล้องตัวอ่อนไก่ ตรวจสอบความมีชีวิตของมัน และทำเครื่องหมายขอบเขตของเงาของการก่อตัวตามธรรมชาติ
สรุปบทเรียน
งานมอบหมายสำหรับบทเรียนต่อไป
คำถามควบคุม
1. โครงสร้างของเอ็มบริโอไก่
2. เหตุใดจึงมีการใช้เอ็มบริโอไก่ในไวรัสวิทยา?
3. โครงสร้างของเอ็มบริโอไก่ที่กำลังพัฒนาเป็นอย่างไร?
วัตถุประสงค์ของบทเรียน:เพื่อให้นักศึกษาคุ้นเคยกับวิธีการแพร่เชื้อตัวอ่อนไก่เพื่อเพาะเชื้อไวรัส
อุปกรณ์และวัสดุ:ตัวอ่อนไก่ ระยะฟักตัว 9-12 วัน ไข่ตก สำลีแอลกอฮอล์ ย่อมาจาก เอ็มบริโอ แหนบ กรรไกร เทปกาว เข็ม กระบอกฉีดยา ดินสอ เข็มเจาะ เข็ม ตาราง ไดอะแกรม อุปกรณ์มัลติมีเดีย การนำเสนอ เอ็มเอส ออฟฟิศ พาวเวอร์พอยต์ในหัวข้อของบทเรียน
คำอธิบายของครู.
วิธีการติดเชื้อส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการสืบพันธุ์ของไวรัสในเอ็มบริโอ ก่อนการติดเชื้อ ไข่ที่ฟักจะโปร่งแสง ส่วนที่ตายแล้วจะถูกแยกออกจากกัน บนเปลือกไข่ที่มีเอ็มบริโอมีชีวิตซึ่งโดดเด่นด้วยสีแดงของหลอดเลือดและการเคลื่อนไหวของเอ็มบริโอบริเวณที่ติดเชื้อจะถูกทำเครื่องหมายด้วยดินสอ
เอ็มบริโอจะติดเชื้อในกล่องปลอดเชื้อ พร้อมด้วยโต๊ะทำงาน อุจจาระ 2 ตัว ระบบจ่ายแก๊ส น้ำประปา และสุญญากาศ การติดเชื้อในช่องน้ำคร่ำเกิดขึ้นในห้องมืด สถานที่ทำงานควรมีแสงสว่างเพียงพอ ก่อนเริ่มงานจะมีการฆ่าเชื้อโต๊ะ เพื่อฆ่าเชื้อพื้นผิวของไข่ ให้เตรียมน้ำยาฆ่าเชื้อ (แอลกอฮอล์ 70% สารละลายไอโอดีน 2%) และแท่งไม้ห่อด้วยสำลี อุปกรณ์วัดทางทันตกรรมแบบงอ หรือสว่านสำหรับเจาะเปลือกไข่ ไข่จะติดเชื้อโดยใช้กระบอกฉีดยาฆ่าเชื้อสำหรับวัณโรคและเข็มพิเศษ บริเวณที่เกิดการติดเชื้อบนไข่จะเต็มไปด้วยพาราฟิน เมื่อต้องการทำเช่นนี้ ให้เตรียมแท่งพาราฟิน: แท่งแก้วถูกสอดเข้าไปในหลอดทดลองที่เต็มไปด้วยพาราฟินหลอมเหลว ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามันอยู่ตรงกลางหลอดทดลองจนกว่าพาราฟินจะเย็นลง
เมื่อต้องการแท่งพาราฟิน ผนังของหลอดทดลองจะถูกทำให้ร้อนบนหัวเผา และดึงพาราฟินออกจากหลอดทดลองโดยใช้แท่งแก้ว ถือแท่งไฟไว้เหนือเปลวไฟ ละลายพาราฟินตามปริมาณที่ต้องการเพื่อปิดรูในไข่ วิธีนี้สะอาดมากและไม่มีควันพาราฟินเกิดขึ้น
นอกจากนี้ แก้วที่มีสำลีปลอดเชื้อ แก้วที่มีสารละลายโซดาไฟ 3% สำหรับเครื่องมือที่ใช้แล้ว และภาชนะที่มีสารละลายคลอรามีนสำหรับวัตถุแก้วที่ใช้แล้วจะถูกวางไว้บนโต๊ะในกล่อง หากจำเป็น คุณสามารถเตรียมถ้วยไข่ ถ้วยเคลือบฟันขนาดเล็ก และอุปกรณ์เพาะเชื้อปลอดเชื้อได้ โต๊ะทำงานที่เตรียมไว้ในลักษณะนี้ต้องผ่านการฉายรังสี UV เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมง
เมื่อพิจารณาถึงความก่อโรคของไวรัสที่กำลังศึกษา งานจะดำเนินการโดยสวมหน้ากาก ถุงมือยาง และแว่นตานิรภัย
มีหกวิธีในการติดเชื้อเอ็มบริโอ การติดเชื้อในโพรง allantoic และเยื่อหุ้ม chorioallantoic มักเกิดขึ้นบ่อยที่สุด โดยมักเกิดขึ้นน้อยในโพรงน้ำคร่ำและในถุงไข่แดง และน้อยมากที่เข้าสู่ร่างกายของเอ็มบริโอและในหลอดเลือดของ CAO การเลือกวิธีการจะขึ้นอยู่กับเขตร้อนของไวรัสตลอดจนวัตถุประสงค์ของการติดเชื้อ ด้วยวิธีการติดเชื้อใด ๆ ให้ฉีดสารติดเชื้อ 0.1-0.2 มิลลิลิตร
การติดเชื้อในช่องอัลลันโทอิก
เมื่อติดเชื้อด้วยวิธีนี้ไวรัสไข้หวัดใหญ่โรคนิวคาสเซิลโรคจมูกอักเสบในม้าโรคปากเปื่อย ฯลฯ จะทวีคูณได้ดี วิธีการมีหลายวิธี
ตัวเลือกแรกตัวอ่อนจะได้รับการแก้ไขในแนวตั้งโดยให้ปลายทื่อหงายขึ้น รูที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 มม. ถูกสร้างขึ้นในเปลือกที่ด้านข้างของเอ็มบริโอ และบางครั้งก็อยู่ด้านตรงข้ามกับเอ็มบริโอ ซึ่งอยู่เหนือขอบของช่องอากาศ 5-6 มม. เข็มถูกสอดขนานกับแกนตามยาวจนถึงความลึก 10-12 มม. (รูปที่ 16) หลังจากฉีดวัสดุที่มีไวรัสแล้ว เข็มจะถูกดึงออก และปิดรูในเปลือกด้วยหยดพาราฟินฆ่าเชื้อที่ละลายแล้ว
รูปที่ 16 การติดเชื้อในช่อง allantoic (ตัวเลือกแรก) (อ้างอิงจาก Nikolaou)
ตัวเลือกที่สองรูที่ทำในเปลือกเหนือช่องอากาศจะใช้เพื่อให้อากาศบางส่วนระบายออกไปเท่านั้น รูสำหรับการติดเชื้อนั้นเกิดขึ้นในบริเวณโซน avascular ของเยื่อหุ้ม chorioallantoic (CAO) ที่ด้านข้างของตัวอ่อน สอดเข็มเข้าไปลึกไม่เกิน 2-3 มม. ฉีดของเหลวติดเชื้อในปริมาตร 0.1-0.2 มล. แล้วปิดรูด้วยพาราฟิน (ดูรูปที่ 17)
การติดเชื้อของเยื่อหุ้ม chorioallantoic
วิธีการติดเชื้อเอ็มบริโอไก่นี้มักใช้ในการเพาะเลี้ยงไวรัส epitheliotropic และ pantropic ของไข้ทรพิษ, กล่องเสียงอักเสบติดเชื้อของนก, โรคไข้หัด, โรค Aujeszky, ลิ้นสีน้ำเงิน ฯลฯ
การติดเชื้อดังกล่าวสามารถทำได้ผ่านช่องอากาศธรรมชาติหรือช่องอากาศเทียม
สำหรับการติดเชื้อ ผ่านช่องอากาศธรรมชาติเอ็มบริโอจะถูกวางในแนวตั้งบนขาตั้งโดยให้ปลายทู่หงายขึ้น และในเปลือกจะมีหน้าต่างทรงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 15-20 มม. ตัดตรงกลางช่องอากาศ ผ่านหน้าต่างนี้เมมเบรน subshell จะถูกลบออกด้วยแหนบ สารแขวนลอยที่มีไวรัส 0.2 มม. ถูกนำไปใช้กับพื้นที่สัมผัสของ CAO (รูปที่ 18) ปิดรูด้วยปูนปลาสเตอร์กาวหรือไม่ค่อยบ่อยนักโดยใช้กระจกปิดเสริมด้วยพาราฟินหลอมเหลว
การติดเชื้อ ผ่านห้องอากาศเทียมถูกใช้บ่อยกว่าครั้งแรก เนื่องจากช่วยให้มั่นใจว่าวัสดุที่มีไวรัสสัมผัสกับพื้นผิว CW ที่ใหญ่กว่า ดังนั้นจึงนำไปสู่การก่อตัวของไวรัสในปริมาณที่มากขึ้น
รูปที่ 17 การติดเชื้อของเอ็มบริโอไก่ในช่องอัลลันโทอิก (ตัวเลือกที่สอง) (อ้างอิงจาก Nikolaou)
รูปที่ 18 การติดเชื้อที่บริเวณเขาผ่านช่องอากาศธรรมชาติ (อ้างอิงจาก Nikolaou et al.)
รูปที่ 19 การติดเชื้อของตัวอ่อนไก่ที่บริเวณเขาผ่านห้องระบายอากาศเทียม (อ้างอิงจาก Nikolaou et al.)
หากต้องการแพร่เชื้อให้กับเอ็มบริโอด้วยวิธีนี้ ให้วางตัวอ่อนไว้ในแนวนอนโดยให้เอ็มบริโอหงายขึ้น มีการสร้างรูสองรูในเปลือก: รูเล็ก ๆ เหนือตรงกลางของช่องอากาศ (ออกแบบมาเพื่อดูดอากาศจากมัน) และอีกรูที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.2-0.5 ซม. ที่ด้านข้างที่ด้านข้างของตัวอ่อน ความซับซ้อนของวิธีการคือเมื่อทำการเจาะรูที่ 2 คุณต้องเอาเปลือกออกอย่างระมัดระวังก่อน จากนั้นจึงเลื่อนเปลือกไปด้านข้างโดยใช้การเคลื่อนที่แบบเลื่อนโดยไม่ทำให้สารเคมีเสียหายเพื่อให้อากาศผ่านได้ ข้อบกพร่อง หลังจากนั้นอากาศจะถูกดูดออกจากห้องอากาศธรรมชาติโดยใช้หลอดยางผ่านรูแรก (รูปที่ 19, a) เป็นผลให้อากาศภายนอกพุ่งเข้ามาผ่านรูด้านข้างทำให้เกิดห้องอากาศเทียมด้านล่าง ซึ่งก็คือ XAO (รูปที่ 19, b)
ผ่านรูด้านข้าง ของเหลวติดเชื้อจะถูกทาลงบนพื้นผิวของ CAO และปิดรูด้วยเทปกาว ไม่จำเป็นต้องปิดรูแรก เนื่องจากชั้นในของเยื่อหุ้มเปลือกไม่ได้รับความเสียหายจากวิธีการติดเชื้อนี้ และยังคงทำหน้าที่เป็นอุปสรรคต่อจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อม
การฟักตัวของเอ็มบริโอที่ติดเชื้อด้วยวิธีนี้เพิ่มเติมจะดำเนินการในแนวนอนโดยหงายช่องด้านข้างขึ้น
การติดเชื้อในถุงไข่แดง
โดยส่วนใหญ่ใช้สำหรับการแพร่กระจายของหนองในเทียม เช่นเดียวกับไวรัสของโรคมาเร็ค ริดนิวโมเนียในม้า ลิ้นสีน้ำเงินของแกะ ฯลฯ พวกมันจะทำให้เอ็มบริโอติดเชื้อในระยะเวลา 5-7 วัน และบางครั้งอาจมีอายุ 2-3 วัน (RIF) ไวรัสไข้หุบเขา) การติดเชื้อมีสองประเภท
ตัวเลือกแรกเอ็มบริโอจะถูกวางในชั้นวางในตำแหน่งตั้งตรง มีการทำรูในเปลือกเหนือศูนย์กลางของช่องอากาศ และสอดเข็มเข้าไปในความลึก 3.5-4 ซม. ที่มุม 45° กับแกนแนวตั้งในทิศทางตรงข้ามกับตำแหน่งของเอ็มบริโอ (รูปที่. 20)
รูปที่ 20 การติดเชื้อของตัวอ่อนลูกไก่ในถุงไข่แดง (อ้างอิงจาก Nicolaou et al.)
ตัวเลือกที่สองบางครั้งเส้นทางการติดเชื้อที่คล้ายกันเกิดขึ้นกับเอ็มบริโอที่ติดตั้งในแนวนอนบนขาตั้ง ขณะที่เอ็มบริโออยู่ด้านล่างและไข่แดงอยู่เหนือมัน รูในเปลือกปิดด้วยพาราฟินหลอมเหลวหยดหนึ่ง
การติดเชื้อในช่องน้ำคร่ำ
เพื่อจุดประสงค์นี้ จะใช้ตัวอ่อนอายุ 6-10 วัน วิธีการใช้เพาะเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ โรคนิวคาสเซิล โรคจมูกอักเสบจากม้า ฯลฯ การติดเชื้อมี 2 วิธี
วิธีการปิดการติดเชื้อจะดำเนินการในกล่องที่มืด ไข่จะถูกวางบนรีโอสโคปในแนวนอนโดยให้เอ็มบริโอหงายขึ้น เข็มที่มีปลายทู่จะถูกสอดเข้าไปในรูในเปลือกเหนือช่องอากาศไปทางตัวอ่อน ข้อพิสูจน์ว่าเข็มทะลุน้ำคร่ำคือการเคลื่อนไหวของร่างกายของทารกในครรภ์ในทิศทางของการเคลื่อนไหว
วิธีการเปิด.เปลือกเหนือช่องอากาศถูกตัดเพื่อสร้างหน้าต่างที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 1.5-2.5 ซม. เมมเบรนเปลือกย่อยจะถูกเอาออกด้วยแหนบภายใต้การควบคุมสายตา จากนั้นจึงนำแหนบทางกายวิภาค (14 ซม.) ที่มีขากรรไกรปิด โดยดันเมมเบรน chorioallantoic ไปทางตัวอ่อน เมื่อแหนบไปถึงขากรรไกรก็จะเปิดออก คว้าเยื่อหุ้มน้ำคร่ำพร้อมกับ CAO แล้วดึงไปที่หน้าต่าง ใช้มือซ้ายจับแหนบโดยให้เมมเบรนแอมเนียนติดอยู่ จากนั้นจะมีวัสดุที่มีไวรัสเข้ามา (รูปที่ 21) จากนั้นเมมเบรนทั้งหมดจะถูกลดระดับลง ปิดหน้าต่างด้วยพลาสเตอร์ปิดแผล และฟักตัวอ่อนในแนวตั้ง
รูปที่ 21 การติดเชื้อของตัวอ่อนลูกไก่เข้าไปในน้ำคร่ำโดยใช้วิธีเปิด (อ้างอิงจาก Nikolaou et al.)
การติดเชื้อในหลอดเลือดของ XAO
เมื่อฟักไข่ในตัวอ่อนอายุ 11-13 วัน จะสังเกตเห็นเส้นเลือดใหญ่ เมื่อดำเนินการต่อไป ส่วนหนึ่งของเปลือกจะถูกเอาออก และทาแอลกอฮอล์ 1-2 หยด ซึ่งจะทำให้เยื่อหุ้มเปลือกโปร่งใสอยู่พักหนึ่ง ภายใต้การควบคุมสายตาโดยใช้เครื่องตรวจไข่ เข็มจะถูกสอดเข้าไปในหลอดเลือด ซึ่งได้รับการยืนยันจากการเคลื่อนไหวด้วยการเคลื่อนไหวของเข็มด้านข้างเล็กน้อย พื้นที่สัมผัสของเมมเบรนใต้เปลือกถูกปิดด้วยแผ่นปูนปลาสเตอร์
วัสดุสามารถนำเข้าไปในภาชนะด้วยวิธีที่แตกต่างออกไปเล็กน้อย: เปลือกเหนือช่องอากาศถูกตัดออก, เมมเบรนเปลือกใต้ชุบแอลกอฮอล์และวัสดุถูกนำเข้าไปในภาชนะ XAO ที่มองเห็นได้ หลุมถูกปิดด้วยเทปกาวฆ่าเชื้อ
วิธีการทางเทคนิคที่อธิบายไว้สำหรับการทดลองติดเชื้อเอ็มบริโอไก่นั้นไม่ได้เป็นเพียงวิธีการเดียว แต่มีตัวเลือกที่หลากหลาย
การติดเชื้อในร่างกายของตัวอ่อน
ตัวอ่อนอายุ 7-12 วันใช้สำหรับการติดเชื้อ วิธีการที่ทราบมีสองเวอร์ชัน
ตัวเลือกแรกพวกเขาติดเชื้อในลักษณะเดียวกับใน amnion ในลักษณะปิดโดยมีความแตกต่างเพียงอย่างเดียวคือใช้เข็มแหลมคมและใน ovoscope ตัวบ่งชี้ที่เข็มเข้าสู่ร่างกายถือเป็นการอยู่ใต้บังคับบัญชาของตัวอ่อนต่อการเคลื่อนไหว ของเข็ม
ตัวเลือกที่สองพวกมันติดเชื้อในน้ำคร่ำในลักษณะเดียวกับที่เปิด: ผ่านหน้าต่างในเปลือกร่างกายของตัวอ่อนจะถูกดึงด้วยแหนบ วัสดุจะถูกฉีดเข้าไปในสมองหรือบริเวณเฉพาะของร่างกาย ด้วยวิธีการติดเชื้อดังกล่าว ทำให้มีเปอร์เซ็นต์การตายของเอ็มบริโอแบบไม่จำเพาะเจาะจงอย่างมีนัยสำคัญ
การสะสมของไวรัสในตัวอ่อนลูกไก่
ก่อนที่จะฟักตัวเพิ่มเติม บนเปลือกของตัวอ่อนไก่ที่ติดเชื้อด้วยวิธีการใดๆ พวกเขาจะเขียนด้วยดินสอธรรมดา (กราไฟท์) ว่าตัวอ่อนติดเชื้ออะไร และข้อมูลอื่น ๆ เมื่อใดและหากจำเป็น ตัวอ่อนไก่ที่ติดเชื้อจะถูกวางไว้ในเทอร์โมสตัทเพื่อการฟักตัวต่อไป ในระหว่างนั้นไวรัสที่ได้รับการแนะนำจะแพร่พันธุ์และสะสมในโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง อุณหภูมิในการฟักตัวของเอ็มบริโอจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ 33 ถึง 38 °C ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของไวรัสที่ติดเชื้อ เอ็มบริโอจะได้รับการตรวจสอบอย่างต่อเนื่อง โดยดูจากกล้องโอสโคป โดยเลือกตัวอ่อน
การตายของเอ็มบริโอใน 24 ชั่วโมงแรกหลังการติดเชื้อส่วนใหญ่มักเกิดจากการแพร่พันธุ์ของเชื้อรา จุลินทรีย์จากแบคทีเรียที่นำเข้าไปในเอ็มบริโอพร้อมกับหัวเชื้อ หรือการบาดเจ็บระหว่างการติดเชื้อ การเสียชีวิตครั้งนี้ถือว่าไม่เฉพาะเจาะจง ในภายหลังตัวอ่อนจะตายเนื่องจากการแพร่พันธุ์ของไวรัสในเอ็มบริโอตามกฎ เมื่อพบตัวอ่อนที่ตายแล้วแล้ว ให้ย้ายเข้าตู้เย็นที่มีอุณหภูมิ 4 °C ทันที เงื่อนไขดังกล่าวมีส่วนช่วยในการรักษากิจกรรมของไวรัสที่สะสมอยู่ในเอ็มบริโอ ในทางกลับกัน เพื่อการบดอัดของเนื้อเยื่อและการรกร้างของหลอดเลือด ซึ่งเอื้อต่อการเปิดในภายหลังอย่างมาก
ตัวอ่อนจะถูกฟักจนเกิดการสะสมของไวรัสสูงสุด สำหรับไวรัสและสายพันธุ์แต่ละชนิด ช่วงเวลานี้จะเฉพาะเจาะจงและแตกต่างกันไปตั้งแต่ 2 ถึง 7-8 วัน ดังนั้นสำหรับไวรัสโรคนิวคาสเซิลสายพันธุ์ H คือ 2-3 วันสำหรับไวรัสสายพันธุ์ B ตัวเดียวกัน 5 วันสำหรับไวรัสกล่องเสียงอักเสบติดเชื้อของนก 5 วัน เป็นต้น จากนั้นตัวอ่อนทั้งหมดจะถูกฆ่าโดยการทำให้เย็นลงที่ 4 ° C เป็นเวลาอย่างน้อย 3-4 ชั่วโมงแล้วเปิด
ไข่ที่ผ่าแล้ว.
วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการนำตัวอ่อนออกจากไข่ในช่วงเวลาที่เยื่อ chorioallantoic ยึดติดกับเปลือกอย่างสมบูรณ์จากด้านใน หากเติมสารอาหารลงในไข่ก็จะเกิดการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อชนิดหนึ่งซึ่งไวรัสสามารถแพร่พันธุ์ได้ วิธีการนี้มีข้อดีหลายประการ: ทำให้สามารถรับไวรัสที่บริสุทธิ์กว่าในน้ำคร่ำอัลลันโทอิกซึ่งมีความสำคัญในการลดคุณสมบัติภูมิแพ้ของวัคซีนที่เตรียมจากวัสดุนี้ การไม่มีถุงไข่แดงและแอนติบอดีจำเพาะที่มีอยู่ในนั้นทำให้ไวรัสบางชนิดสามารถแพร่พันธุ์ได้ดีขึ้น ในบางกรณี วิธีการนี้ให้ผลลัพธ์ที่ดีในการตรวจวินิจฉัย เนื่องจากสามารถใส่วัสดุทดสอบได้จำนวนมาก ซึ่งเพิ่มความเป็นไปได้ของการแยกไวรัส
วิธีการนี้เสนอโดย Bernkopf เมื่อปี 1949 แต่เนื่องจากความยากลำบากในการใช้งาน จึงไม่ค่อยมีการใช้กันอย่างแพร่หลาย ปัญหาเหล่านี้เกี่ยวข้องกับคุณสมบัติของเยื่อหุ้ม chorioallantoic ที่จะแยกออกจากเปลือกในระหว่างการฟักตัว ซึ่งจะลดคุณค่าของการเพาะเลี้ยง และทำให้การจัดการในการรับไวรัสและการเปลี่ยนสารอาหารมีความซับซ้อนยิ่งขึ้น
E. Groiel (1963) นำเสนอการปรับเปลี่ยนหลายอย่างที่ช่วยขจัดปัญหาเหล่านี้ เขาแนะนำให้ใช้ไข่ที่มีอายุ 15 วันหรือแก่กว่านั้น ซึ่งควรพลิกบ่อยๆ ระหว่างการฟักไข่เพื่อให้แน่ใจว่าเปลือกบนเปลือกไข่จะพัฒนาสม่ำเสมอ เมื่อได้รับแสงทรานส์ลูมิเนท ขอบเขตของช่องอากาศจะถูกระบุ เปลือกถูกเลื่อยออกเหนือเส้นนี้ 0.5 ซม. แล้วเทพาราฟินหลอมเหลว (56-58 C°) ลงบนขอบของเปลือก ซึ่งจะทำให้ขอบไข่แข็งตัวและยึดติด จากนั้นเจาะรูกลมในเมมเบรนเหนือเอ็มบริโอ โดยเหลือขอบแคบๆ ไว้รอบๆ ขั้นตอนต่อไปคือการเอาตัวอ่อนออกจากไข่อย่างระมัดระวัง ในกรณีนี้ ควรจับไข่ในแนวนอนและหมุนช้าๆ ด้วยวิธีนี้ จะพบภาชนะที่เชื่อมต่อตัวอ่อนกับ CAO และตัดด้วยกรรไกร หากจับไข่ในแนวตั้งตัวอ่อนที่มีมวลจะดึงเปลือกกลับคืนมาโดยปกติจะฉีกออกบริเวณปลายแหลมของไข่ การเข้ามาของของเหลวในปริมาณเล็กน้อยระหว่างสารเคมีกับเปลือกจะทำให้เปลือกหลุดออกโดยสมบูรณ์ภายใน 1-2 วัน
หลังจากนำเอ็มบริโอออกแล้ว ให้ล้างเมมเบรนที่บุไข่หลาย ๆ ครั้งด้วยน้ำเกลือที่ทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิ 4-0°C จนกระทั่งของเหลวใส จากนั้นนำสารอาหาร 20 มล. ที่ให้ความร้อนถึง 37 ° C เข้าไปในโพรงไข่และปิดไข่ด้วยฝายางที่ผ่านการฆ่าเชื้อโดยแช่ไว้ในพาราฟินก่อนหน้านี้ ท่อที่มีจุกยางฝังอยู่ในไข่ช่วยให้สามารถรวบรวมและจ่ายของเหลวได้โดยไม่ต้องเสี่ยงต่อการปนเปื้อนของแบคทีเรีย วัตถุทางชีวภาพดังกล่าวยังคงมีชีวิตอยู่ได้เป็นเวลาหลายวัน
ตามวิธีการของโยชิโนะและคนอื่นๆ โพรงของไข่ที่แยกไข่ออกจะเต็มไปด้วยสารละลายวุ้นในสารละลายของแฮงค์ส ไข่ที่แยกออกจากไข่จะติดเชื้อผ่านท่อในฝา
คำถามควบคุม:
1. โครงสร้างของเอ็มบริโอไก่
2. เหตุใดจึงมีการใช้เอ็มบริโอไก่ในไวรัสวิทยา?
3. โครงสร้างของเอ็มบริโอไก่ที่กำลังพัฒนาเป็นอย่างไร?
การแยกไวรัสในสัตว์ทดลอง
การเลือกสัตว์ทดลองขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัส สัตว์ทดลองถือเป็นแบบจำลองทางชีววิทยา บางครั้งจำเป็นต้องดำเนินการ "ตาบอด" 3-5 ครั้งโดยไม่มีอาการก่อนที่จะสามารถปรับไวรัสให้เข้ากับสภาพห้องปฏิบัติการได้ อย่างไรก็ตาม สัตว์ทดลองไม่ไวต่อไวรัสบางชนิด ซึ่งในกรณีนี้จำเป็นต้องใช้สัตว์ที่ไวต่อไวรัสตามธรรมชาติ ตัวอย่างเช่นมีไข้สุกรและโรคโลหิตจางจากการติดเชื้อในม้า
วัตถุประสงค์ของการติดเชื้อในสัตว์ทดลอง:
1. ศึกษาการเกิดโรค
2. แยกไวรัสออกจากวัสดุที่ทำให้เกิดโรค
3. การผลิตเซรั่มภูมิคุ้มกันและภูมิต้านทานเกิน
4. การผลิตวัคซีน
5. การบำรุงรักษาไวรัสในสภาพห้องปฏิบัติการ
6. การไทเทรตเพื่อกำหนดปริมาณไวรัสต่อหน่วยปริมาตร
7. แบบจำลองทางชีวภาพสำหรับการแสดงปฏิกิริยาการวางตัวเป็นกลาง
การเลือกวิธีการแพร่เชื้อในสัตว์ทดลองขึ้นอยู่กับเขตร้อนของไวรัส ดังนั้นเมื่อปลูกฝังไวรัสนิวโรโทรปิก สัตว์จึงติดเชื้อเข้าสู่สมอง ระบบทางเดินหายใจ intranasally, intratracheally; Dermatropic - ใต้ผิวหนังและในผิวหนัง
การติดเชื้อจะดำเนินการตามกฎของภาวะปลอดเชื้อและน้ำยาฆ่าเชื้อ
มีหลายวิธีในการนำสารที่มีไวรัสเข้าสู่ร่างกายของสัตว์:
ใต้ผิวหนัง; - สมอง; - ในผิวหนัง;
เยื่อบุช่องท้อง; - กล้ามเนื้อ; - ลูกตา;
ทางหลอดเลือดดำ; - ในจมูก; - โภชนาการ;
หลังการติดเชื้อ สัตว์จะถูกทำเครื่องหมาย วางในกล่องแยก และเฝ้าติดตามเป็นเวลา 10 วัน การตายของสัตว์ในวันแรกหลังการติดเชื้อถือว่าไม่เฉพาะเจาะจงและจะไม่นำมาพิจารณาในภายหลัง
3 สัญญาณบ่งบอกถึงประสิทธิภาพของการติดเชื้อ:
การปรากฏตัวของอาการทางคลินิก
ความตายของสัตว์
การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (ขนาด รูปร่าง สี และความสม่ำเสมอของอวัยวะ)
เอ็มบริโอไก่คือไข่ไก่ที่ได้รับการปฏิสนธิซึ่งเอ็มบริโอ (เอ็มบริโอ) พัฒนาขึ้น การเพาะเลี้ยงไวรัสในตัวอ่อนไก่และนกกระทาได้กลายเป็นที่แพร่หลายเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยเป็นหนึ่งในวิธีที่ง่ายและน่าเชื่อถือที่สุดในการเพาะและวินิจฉัยไวรัสและแบคทีเรียบางชนิด - บรูเซลลา, ริกเก็ตเซีย, วิบริโอ
ไวรัสของมนุษย์และสัตว์สามารถเพาะเลี้ยงได้ในการพัฒนาเอ็มบริโอไก่ เนื้อเยื่อของตัวอ่อน โดยเฉพาะเยื่อหุ้มของเอ็มบริโอซึ่งอุดมไปด้วยเนื้อเยื่อเยื่อบุผิวที่เป็นเชื้อโรค เป็นสภาพแวดล้อมที่เอื้ออำนวยต่อการแพร่กระจายของไวรัสหลายชนิด ไวรัสที่มีคุณสมบัติ epitheliotropic (ไข้ทรพิษ, ILT ฯลฯ ) พัฒนาได้สำเร็จบนเยื่อหุ้มเซลล์ chorioallantoic ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า ตัวแทนต่างๆ ของ myxoviruses (ไข้หวัดใหญ่, โรคนิวคาสเซิล, โรคไข้หัดสุนัข ฯลฯ ), ไวรัสหลอดลมอักเสบติดเชื้อ, ไวรัสตับอักเสบลูกเป็ด, arboviruses ฯลฯ สืบพันธุ์ได้ดีในตัวอ่อนเมื่อนำวัสดุเข้าไปในโพรงอัลลันโทอิก ไวรัสบางชนิดสามารถเพาะเลี้ยงในถุงไข่แดงได้สำเร็จ
ข้อดี:
1. ทำกำไรได้อย่างประหยัด นอกจากนี้ยังหาไข่ได้ง่าย
2. การพัฒนาเอ็มบริโอไก่ขาดกลไกในการป้องกันเพราะว่า ระบบภูมิคุ้มกันยังไม่พัฒนา
3. เปลือกไข่ป้องกันแบคทีเรียและไวรัสจากสิ่งแวดล้อมไม่ให้ทะลุผ่านได้
ในการเพาะเลี้ยงและแยกไวรัสออกจากเอ็มบริโอของไก่ จำเป็นต้องใช้อุปกรณ์ง่ายๆ เช่น เทอร์โมสตัทหรือตู้ฟักแบบปกติ
เงื่อนไข:
1. ไข่ได้มาจากฟาร์มที่ปลอดจากโรคติดเชื้อ
2. จะดีกว่าถ้าได้เอ็มบริโอไก่จากไก่พันธุ์ขาว (Leghorn, Russian White) เพราะพวกมันทนทานต่อการยักยอกมากกว่าและไม่ตายจากอาการบาดเจ็บเล็กน้อย นอกจากนี้เปลือกของพวกมันยังมีสีขาวและโปร่งใสกว่าสายพันธุ์อื่น และมองเห็นได้ง่ายกว่า ซึ่งสะดวกในการดูและสังเกตขณะทำงานกับพวกมัน
3. สำหรับการฟักไข่จะเลือกไข่ที่ปฏิสนธิวางไม่เกิน 10 วันก่อน
4. นำไข่ที่ไม่ปนเปื้อน เนื่องจากไม่สามารถล้างก่อนฟักไข่ได้ และไข่ที่สกปรกจะมองเห็นได้น้อยลงเมื่อตรวจดู (การส่องกล้อง) และเมื่อทำงานกับไข่เหล่านั้น ตัวอ่อนอาจติดเชื้อได้ในระหว่างกระบวนการจัดการ
ไข่จะถูกฟักในตู้ฟักหรือในเทอร์โมสตัทที่มีเครื่องทำน้ำร้อนและอากาศเข้า และในระหว่างการฟักไข่ในเทอร์โมสตัทนั้น จะต้องกลับไข่วันละ 2-3 ครั้ง และเพื่อการแลกเปลี่ยนก๊าซที่ดีขึ้น ให้นำออกมาเป็นเวลา 5-10 นาทีขึ้นไปในอากาศ เพื่อรักษาความชื้นในระดับหนึ่ง ให้วางภาชนะที่มีน้ำไว้ในเทอร์โมสตัทเพื่อการระเหย อุณหภูมิในเทอร์โมสตัทควรอยู่ที่ 38°
การพัฒนาของตัวอ่อนเกิดขึ้นแล้วในวันแรกของการฟักตัว การวางสมองและโครงกระดูกเกิดขึ้น โครงสร้างของตัวอ่อนไก่เมื่ออายุ 7-9 วัน(ดูสมุดบันทึก)
สำหรับการติดเชื้อมักใช้ตัวอ่อนอายุ 7-12 วันเป็นส่วนใหญ่ การทำงานกับเอ็มบริโอไก่จะดำเนินการในกล่องห้องปลอดเชื้อโดยยึดถือปลอดเชื้ออย่างเข้มงวดที่สุด
วัตถุประสงค์ของการติดเชื้อเอ็มบริโอไก่คือ:
1. แยกซับออกจากวัสดุสิทธิบัตร
2. การพัฒนาวัคซีน
3. การดูแลรักษาไวรัสในห้องปฏิบัติการ
4. การไตเตรทของไวรัส
5. แบบจำลองทางชีวภาพสำหรับการแสดงปฏิกิริยาการวางตัวเป็นกลาง
6. การศึกษาการแทรกแซงของไวรัสและการผลิตอินเตอร์เฟอรอน การติดเชื้อของตัวอ่อนไก่:
สำหรับการติดเชื้อ จะต้องเลือกตัวอ่อนที่มีชีวิตและมีความสามารถในการเคลื่อนไหวที่ชัดเจน ก่อนการติดเชื้อ ตัวอ่อนทั้งหมดจะได้รับการตรวจอย่างระมัดระวังในห้องมืดโดยใช้เครื่องตรวจไข่
ในระหว่างการปักเทียนตัวอ่อนก่อนการติดเชื้อ ปูกา (ช่องอากาศ) เส้นทางของหลอดเลือดขนาดใหญ่และตำแหน่งที่ปรากฏของตัวอ่อนจะถูกร่างไว้บนเปลือกด้วยดินสอง่ายๆ เช่น บริเวณบนเปลือกที่ตัวอ่อนอยู่ใกล้ที่สุด มัน. เครื่องหมายของปั๊ก ตำแหน่งที่ปรากฏของเอ็มบริโอ และเส้นทางของหลอดเลือดขนาดใหญ่ จะทำหน้าที่เป็นแนวทางในการเลือกตำแหน่งที่จะแนะนำวัสดุที่มีไวรัสในขณะที่ติดเชื้อ
เอ็มบริโอไก่ที่ได้รับการคัดเลือกสำหรับการติดเชื้อจะถูกถ่ายโอนไปยังกล่องเพื่อนำไปเพาะเลี้ยง ก่อนการติดเชื้อ เปลือกบริเวณที่ฉีดจะได้รับการบำบัดด้วยแอลกอฮอล์เสริมไอโอดีนสองครั้งแล้วเผา ปริมาณการติดเชื้อคือ 0.1-0.2 ซม.
ขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัสและวัตถุประสงค์ของการติดเชื้อจะแตกต่างกันไป วิธีการแนะนำวัสดุที่มีไวรัส:
1) การติดเชื้อของเยื่อหุ้ม chorioallantoic , ตัวอ่อนอายุ 7-12 วันใช้ในการแยกและการเพาะเลี้ยงไวรัส neurotropic, dermatropic และ pantropic บางชนิด (ไข้ทรพิษ, ไข้สมองอักเสบ, ILT, โรคปากและเท้าเปื่อย, โรคพิษสุนัขบ้า, โรคระบาด ฯลฯ ) มี 3 ตัวเลือกการติดเชื้อ:
ก) เปิด puga แล้วตัดออกด้วยกรรไกร แยกเยื่อหุ้มเปลือกออก และทาวัสดุบนเยื่อ chorioallantoic (CAO) จากนั้นปิดรูในไข่ด้วยฝาแก้วที่ปราศจากเชื้อ และขอบของฝาจะแว็กซ์
b) สามเหลี่ยมที่มีความยาวด้านข้างประมาณ 1 ซม. ถูกตัดออกด้วยตะไบเข็ม (ตะไบ) หรือมีดผ่าตัดแบบหยักในเปลือกที่ขอบของ pugi จากด้านข้างของการนำเสนอของตัวอ่อนซึ่งเป็นส่วนของเปลือก และเมมเบรนชั้นในจะถูกถอดออกด้วยแหนบและฉีดวัสดุเข้าไป ปิดรูด้วยกระจกครอบที่ผ่านการฆ่าเชื้อ และขอบแว็กซ์หรือปิดผนึกด้วยพลาสเตอร์ปิดแผลที่ปราศจากเชื้อ
c) พื้นที่เปลือกเล็ก ๆ ที่มีพื้นที่ประมาณ 0.5 ซม. จะถูกเอาออกด้วยมีดผ่าตัดในบริเวณที่มีตัวอ่อนอยู่จากนั้นเยื่อหุ้มชั้นนอกจะถูกเอาออกในบริเวณนี้โดยใช้แหนบหรือเข็มและวัสดุ ถูกฉีด หากวัสดุไม่พอดีกับโพรงของไข่ คุณสามารถใช้กระเปาะยางเพื่อสูบลมออกจากไข่ผ่านรูในเปลือกบนไข่ และเป็นผลให้ไข่เทียมเกิดขึ้นที่ สถานที่ที่นำวัสดุเข้ามาแล้วจึงใส่วัสดุได้ง่าย รูในเปลือกถูกปิดด้วยปูนปลาสเตอร์หรือแว็กซ์
2) การติดเชื้อในช่องอัลลันโทอิก วิธีการติดไวรัสนี้ง่ายมาก และใช้เพื่อแยกไวรัสหลายชนิด สำหรับการติดเชื้อ จะใช้ตัวอ่อนอายุ 10-11 วัน มีสองตัวเลือกในการติดเชื้อ:
ก) การติดเชื้อเกิดขึ้นผ่านทาง puga โดยไม่ต้องตัดออก ใช้เข็มวัดระยะห่างจากด้านบนของ puga ถึงขอบของ puga โดยใช้ดินสอทำเครื่องหมายไว้ที่เปลือก แล้วสอดเข็มไปที่ความลึกที่ทำเครื่องหมายไว้และลึกลงไปอีก 0.5 ซม. เพื่อเจาะเยื่อหุ้ม chorioallantoic
b) วัสดุถูกสอดด้วยเข็มผ่านการเจาะเข้าไปในเปลือก ณ ตำแหน่งที่มีการนำเสนอตัวอ่อนจนถึงระดับความลึก 3-5 มม. ในบริเวณที่มีหลอดเลือด รูในเปลือกถูกปิดด้วยปูนปลาสเตอร์หรือแว็กซ์
3) การติดเชื้อในถุงไข่แดง ตัวอ่อนอายุ 5-8 วันใช้สำหรับการติดเชื้อ มีสองตัวเลือกในการติดเชื้อ:
ก) สอดเข็มจากด้านข้างของบูชาเข้าไปในถุงไข่แดงโดยทำมุม 45° ไปยังตำแหน่งที่ปรากฏของตัวอ่อนภายใต้การควบคุมของกล้องตรวจไข่
b) วางไข่บนขาตั้งโดยให้ตัวอ่อนชี้ลง และสอดเข็มจากบนลงล่างเข้าหาตัวอ่อนจนถึงความลึกประมาณ 1 ซม.
บริเวณที่ฉีดถูกปิดผนึกด้วยเทปกาวและพาราฟิน 4) การติดเชื้อในช่องน้ำคร่ำด้วยวิธีการติดเชื้อนี้ ไวรัสสามารถแทรกซึมและเพิ่มจำนวนในเซลล์ต่างๆ ที่สัมผัสกับน้ำคร่ำได้ เพื่อความสะดวกในการติดเชื้อ แนะนำให้ฟักตัวอ่อน 2-3 วันก่อนติดเชื้อโดยหงายหน้าขึ้น จากนั้นเอ็มบริโอและน้ำคร่ำจะเคลื่อนตัวขึ้นด้านบนและติดเชื้อได้สะดวกยิ่งขึ้น มีสองตัวเลือกในการติดเชื้อ:
ก) เปิดและตัด puga ออก ใช้แหนบเอาเยื่อหุ้มชั้นนอกออกแล้วหยิบน้ำคร่ำ ดึงน้ำคร่ำด้วยแหนบแล้วนำวัสดุในขนาด 0.1 มล. เข้าไปในช่องน้ำคร่ำ จากนั้นปิดรูในเปลือกด้วยฝาแก้วปลอดเชื้อและขอบด้วยแว็กซ์
b) การติดเชื้อโดยใช้เข็มยาวผ่าน puga ในห้องมืดภายใต้การควบคุมสายตา ขั้นแรกให้งอปลายเข็มเป็นมุมฉากเพื่อสร้างพื้นที่ขนาดเล็ก เข็มถูกสอดเข้าไปภายใต้การควบคุมของตาผ่านทางส่วนที่ยื่นออกมาของตัวอ่อนก่อนตัวอ่อน ในกรณีนี้ ภายใต้แรงกดของเข็มทื่อ ตัวอ่อนจะเคลื่อนไหว จากนั้นน้ำคร่ำจะถูกเจาะด้วยการกดเล็กน้อย และเข็มจะขยับเล็กน้อย ดึงกลับ ในกรณีนี้ ตัวอ่อนควรขยับขึ้นไปด้านหลังเข็ม จากนั้นจึงแนะนำวัสดุ
5) การติดเชื้อเข้าสู่ร่างกายของเอ็มบริโอและการติดเชื้อเข้าสู่สมอง ใช้ตัวอ่อนอายุ 7-12 วัน การติดเชื้อทำได้โดยการนำวัสดุเข้าสู่ส่วนต่างๆ ของร่างกาย หรือเข้าสู่สมองโดยตรง สำหรับการติดเชื้อ พูกาจะเปิดออกและดึงตัวอ่อนออกด้วยแหนบ ด้วยวิธีการติดเชื้อเหล่านี้ ตัวอ่อนที่ติดเชื้อมากถึง 30% หรือมากกว่าอาจเสียชีวิตจากการบาดเจ็บ
6) การติดเชื้อในหลอดเลือดขนาดใหญ่ของเยื่อหุ้ม chorioallantoic วิธีการติดเชื้อนี้เหมือนกับวิธีก่อนหน้านั้นใช้น้อยมาก วัสดุจะถูกฉีดด้วยเข็มบางๆ หลังจากเอาเปลือกตามหลอดเลือดออกโดยตรงเข้าไปในหลอดเลือดตามการไหลเวียนของเลือด
หลังการติดเชื้อ จะต้องทำเครื่องหมายตัวอ่อนไก่ด้วยดินสอง่ายๆ และวางไว้ในเทอร์โมสตัท มีการตรวจติดตามทุกวันโดยการชม โดยจะสังเกตได้นานถึง 7-8 วัน ขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัส หากตัวอ่อนตาย พวกมันจะถูกเอาออกจากเทอร์โมสตัททันทีและนำไปแช่ในตู้เย็นจนกระทั่งเปิด หากเอ็มบริโอเสียชีวิตภายใน 14-18 ชั่วโมงแรก อาจเกิดจากการบาดเจ็บหรือความเป็นพิษของสารทางพยาธิวิทยา ดังนั้น เช่นเดียวกับเมื่อแพร่เชื้อในสัตว์ทดลอง ในกรณีที่มีข้อสงสัย แนะนำให้ทำหลายช่องและนำตัวอ่อนหลายตัวสำหรับแต่ละวัสดุ
การชันสูตรพลิกศพไก่ที่ติดเชื้อที่ตายหรือเอาออกหลังจากพ้นระยะเวลาสังเกตแล้ว จะดำเนินการตามกฎของอาเซพซิสทุกประการในสภาพชกมวยปลอดเชื้อ เมื่อเปิดเปลือกออก เปลือกจะถูกชุบแอลกอฮอล์แล้วเผา จากนั้นจึงตัดพุก้าออก จากตัวอ่อนที่เปิดอยู่น้ำอัลลันโทอิกจะถูกดูดออกอย่างระมัดระวังในขั้นแรก (ปริมาณประมาณ 7 มล.) จากนั้นเยื่อหุ้มน้ำคร่ำจะถูกดึงกลับด้วยแหนบเจาะด้วยปิเปตของปาสเตอร์และน้ำคร่ำจะถูกดูดออก (จำนวน 1.0- 1.5 มล.) จากนั้นเก็บไข่แดง เยื่อหุ้มเซลล์และตัวอ่อนจะถูกเอาออก มีการตรวจสอบของเหลว เยื่อหุ้มเซลล์ และตัวอ่อนอย่างระมัดระวังเพื่อดูการเปลี่ยนแปลง น้ำคร่ำโดยปกติจะใสสะอาด แต่เมื่อติดเชื้อแล้ว อาจมีสีขุ่นและมีเลือดปนได้ การเปลี่ยนแปลงลักษณะที่เกิดจากไวรัสจะเด่นชัดที่สุดในเยื่อหุ้มเซลล์ chorioallantoic: จุดโฟกัสของการอักเสบปรากฏ ทึบแสง มีรูปร่างกลม และมีเลือดออก อาการตกเลือดอาจเกิดขึ้นบนร่างกายของตัวอ่อน วัสดุทั้งหมดจะถูกรวบรวมในภาชนะที่ปลอดเชื้อ
ในด้านไวรัสวิทยา เอ็มบริโอไก่ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายไม่เพียงแต่สำหรับการแยกไวรัสเท่านั้น แต่ยังสำหรับการสะสมและรับแอนติเจน เพื่อเตรียมวัคซีนที่มีชีวิตและฆ่าแล้ว การไตเตรทไวรัส สำหรับการแสดงปฏิกิริยาการวางตัวเป็นกลางของไวรัส เพื่อลดไวรัส (ทำให้อ่อนแอลง) ไวรัส เพื่อศึกษาการแทรกแซง ของไวรัสและการได้รับอินเตอร์เฟอรอน
การแยกและการเพาะเลี้ยงไวรัส
การแยกและจำแนกเชื้อโรคถือเป็น “มาตรฐานทองคำ” ในการวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัส
การเพาะเลี้ยงเซลล์
ไวรัสแพร่พันธุ์ในเซลล์ที่มีชีวิตเท่านั้น และการแยกเชื้อโรคในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ติดเชื้อเป็นหนึ่งในวิธีการหลักในการวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัส เนื่องจากไวรัสที่ก่อโรคส่วนใหญ่จำแนกตามเนื้อเยื่อและความจำเพาะของชนิด จึงเป็นไปได้ที่จะเลือกเซลล์หรือเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เหมาะสมสำหรับไวรัสเกือบทุกตัว รวมทั้งสร้างเงื่อนไขการเพาะเลี้ยงที่เป็นมาตรฐาน (การมีอยู่ของเซลล์ประเภทเดียวกัน) การสืบพันธุ์ของไวรัสนั้นมั่นใจได้โดยเซลล์ที่ละเอียดอ่อน (อนุญาต) ดังนั้นเมื่อมีการแยกเชื้อโรคที่ไม่รู้จักออกไป การเพาะเลี้ยงเซลล์ 3-4 เซลล์จะติดเชื้อพร้อมกัน โดยถือว่าหนึ่งในนั้นอาจอนุญาตได้ การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้มาจากการกระจายอวัยวะและเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง แต่บ่อยครั้งที่พวกเขาใช้เนื้อเยื่อของตัวอ่อน (มนุษย์และสัตว์) หรือเซลล์เนื้องอกที่ถูกเปลี่ยนรูป เมื่อวางบนพื้นผิวเรียบที่เหมาะสม โดยทั่วไปการเพาะเลี้ยงเซลล์จะเติบโตเป็นชั้นเดียว
วัฒนธรรมทริปซิไนซ์เบื้องต้นสารแขวนลอยของเซลล์ได้มาจากการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อที่เหมาะสมที่ได้รับการบำบัดด้วยทริปซินล่วงหน้า การเพาะเลี้ยงมักเป็นเซลล์ผสมและไม่สามารถเพาะเลี้ยงซ้ำได้ ความมีชีวิตของพืชผลดังกล่าวคือ 2-3 สัปดาห์
เส้นเซลล์กึ่งต่อเนื่องแสดงโดยเซลล์ซ้ำของมนุษย์และสัตว์ วัฒนธรรมมีความเหมาะสมอย่างจำกัดสำหรับการแพร่กระจายและการเติบโตซ้ำๆ (ตามกฎแล้วไม่เกิน 20-30 ข้อความ) ในขณะที่ยังคงความมีชีวิตและไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงตามธรรมชาติ
เส้นเซลล์ต่อเนื่อง(วัฒนธรรมเฮเทอโรพลอยด์) จะแสดงโดยเซลล์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยงในระยะยาวและการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นเอง วัฒนธรรมสามารถแพร่กระจายและย้ายปลูกซ้ำได้ การทำงานร่วมกับพวกเขานั้นลำบากน้อยกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการเตรียมวัฒนธรรมปฐมภูมิ เซลล์ที่ปลูกถ่ายจะมีสัณฐานวิทยาค่อนข้างสม่ำเสมอและมีคุณสมบัติคงที่
วัฒนธรรมอวัยวะ
เซลล์บางชนิดไม่สามารถเติบโตเป็นชั้นเดียวได้ ในบางกรณี การบำรุงรักษาเซลล์ที่แตกต่างสามารถทำได้เฉพาะในการเพาะเลี้ยงอวัยวะเท่านั้น โดยปกติจะเป็นเนื้อเยื่อแขวนลอยที่มีหน้าที่เฉพาะหรือเรียกอีกอย่างว่า วัฒนธรรมของการสัมผัสกับเนื้อเยื่อ
เอ็มบริโอไก่ (รูปที่. 1-20) - แบบจำลองที่เกือบจะสมบูรณ์แบบสำหรับการเพาะไวรัสบางชนิด (เช่น ไข้หวัดใหญ่และหัด) ช่องปิดของตัวอ่อนป้องกันการแทรกซึมของจุลินทรีย์จากภายนอกตลอดจนการพัฒนาของการติดเชื้อไวรัสที่เกิดขึ้นเอง เอ็มบริโอใช้สำหรับการแยกไวรัสเบื้องต้นจากสารทางพยาธิวิทยา เพื่อส่งต่อและเก็บรักษารวมทั้งเพื่อให้ได้ไวรัสในปริมาณที่จำเป็น เชื้อโรคบางชนิด (เช่น เริมไวรัส) ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะเฉพาะ (สามารถใช้เพื่อรับรู้โรคได้) การติดเชื้อจะเกิดขึ้นที่เยื่อหุ้มเซลล์ chorion-allantoic ในช่องน้ำคร่ำหรือ allantoic หรือในถุงไข่แดง
การติดเชื้อของเยื่อหุ้มคอรีออน-อัลลานโตอิกโดยปกติจะใช้ตัวอ่อนอายุ 10-12 วัน ไข่จะถูกมองด้วยแสงที่ส่องผ่าน มีการระบุตำแหน่งของถุงลม และเลือกพื้นที่ที่ไม่มีหลอดเลือด นำเศษเปลือกออกอย่างระมัดระวัง ปล่อยเปลือกนอกออกแล้วลอกออกด้วยแรงกดเบาๆ จากนั้นเจาะรูที่ขอบถุงลม เมื่อดูดผ่านรูนี้ เยื่อ Chorion-Allantoic จะขัดผิวออกจากเปลือกนอก ใช้วัสดุทดสอบโดยไม่มีแบคทีเรียและโปรโตซัว (ผ่านตัวกรองแบคทีเรียและบำบัดด้วยสารฆ่าเชื้อแบคทีเรีย)
การติดเชื้อในช่องน้ำคร่ำโดยทั่วไปแล้ว จะใช้ตัวอ่อนอายุ 7-14 วัน ซึ่งหลังจากแยกเยื่อหุ้ม chorionic-allantoic (ดูด้านบน) แล้ว ช่องเปิดจะขยายออก เยื่อหุ้มน้ำคร่ำจะถูกจับด้วยแหนบแล้วเอาออกผ่านเยื่อหุ้ม chorionic-allantoic โดยวัสดุทดสอบจะถูกนำเข้าไปในช่องน้ำคร่ำ
การติดเชื้อในช่องอัลลันโทอิกเอ็มบริโออายุ 10 วันจะติดเชื้อผ่านรูที่สร้างในเปลือกและเยื่อใต้ผิวหนัง (ดูด้านบน)
การติดเชื้อในถุงไข่แดงจะใช้ตัวอ่อนอายุ 3-8 วัน ซึ่งในวัยนี้ถุงไข่แดงจะครอบครองเกือบทั้งโพรงไข่ การติดเชื้อจะดำเนินการผ่านรูที่ทำไว้ในถุงลม
การสังเกตและการบันทึกผลลัพธ์เนื่องจากเป็นวัสดุที่มีไวรัส คุณสามารถใช้เนื้อหาของถุงไข่แดง น้ำอัลลันโทอิกและน้ำคร่ำ หรือตัวอ่อนทั้งหมด โดยตัดร่วมกับบริเวณโดยรอบ
ผ้าเป็นชิ้นๆ เพื่อระบุรูป 1-20.ภาพประกอบแบบแผนผัง
ลักษณะรอยโรคบนคอของตัวอ่อนลูกไก่ที่กำลังพัฒนา
เปลือกจะถูกลบออกจากเยื่อหุ้มอัลลันโตอิก
และเปลือกนอก จากนั้นจึงนำเมมเบรนออกและวางในน้ำปลอดเชื้อ มีการศึกษาธรรมชาติของรอยโรคบนพื้นหลังสีเข้ม
โมเดลสัตว์
หากไม่สามารถแยกและระบุไวรัสได้โดยใช้วิธีมาตรฐาน ในหลอดทดลองวัสดุติดเชื้อจะถูกจัดการให้กับสัตว์ที่ไวต่อเชื้อโรค และหลังจากการพัฒนาของกระบวนการติดเชื้อทั่วไป การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ละเอียดอ่อนจะถูกติดเชื้ออีกครั้ง ที่ใช้กันมากที่สุดคือหนู กระต่ายและลิง เพื่อแยกไวรัสบางชนิด (เช่น ไวรัสคอกซากี) หนูที่ดูดนมจะติดเชื้อ เนื่องจากมีค่าใช้จ่ายสูงและซับซ้อนในการเลี้ยงสัตว์ทดลอง สัตว์ทดลองจึงถูกแทนที่ด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์เกือบทุกที่ อย่างไรก็ตาม มีการใช้แบบจำลองสัตว์เพื่อศึกษาลักษณะของการเกิดโรคและการก่อตัวของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันระหว่างการติดเชื้อไวรัส
อ่านเพิ่มเติม:
|
ไวรัสหลายชนิดที่ติดเชื้อในมนุษย์และสัตว์สามารถเพิ่มจำนวนในตัวอ่อนลูกไก่ได้ไม่มากก็น้อย การมีเปลือกหนาทึบช่วยปกป้องเอ็มบริโอจากจุลินทรีย์จากสภาพแวดล้อมภายนอก
วิธีการเพาะเลี้ยงไวรัสในเอ็มบริโอไก่ใช้ในการวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัสในห้องปฏิบัติการตลอดจนการผลิตวัคซีนไวรัสและการเตรียมการวินิจฉัย แต่วิธีนี้มีข้อเสีย: 1) เป็นไปไม่ได้ที่จะสังเกตการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่เกิดขึ้นในตัวอ่อนหลังจากติดเชื้อไวรัสในพลวัต; 2) เมื่อเปิดเอ็มบริโอที่ติดเชื้อไวรัส มักตรวจไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มองเห็นได้ และจำเป็นต้องตรวจจับการมีอยู่ของไวรัสในเนื้อเยื่อ ในของเหลวของเอ็มบริโอ โดยใช้วิธีการทางไวรัสวิทยาอื่นๆ (เช่น ปฏิกิริยาการเกิดเม็ดเลือดแดงแตก) ); 3) วิธีการเพาะเลี้ยงตัวอ่อนไก่ไม่เหมาะกับไวรัสทุกชนิด แม้จะมีข้อบกพร่องอยู่ แต่วิธีนี้ค่อนข้างง่าย สะดวก และราคาถูก และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาทางไวรัสวิทยา มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อทำงานกับ orthomyxoviruses, herpesviruses, poxviruses
1.3.1. โครงสร้างของตัวอ่อนไก่
เอ็มบริโอไก่ถูกปกคลุมไปด้วยเปลือกปูน - เปลือกซึ่งเปลือกติดกับเปลือกหอยจากด้านใน ที่ปลายทู่ของไข่ มันจะแยกออกเป็นสองส่วนและปิดช่องอากาศไว้ ใต้เยื่อหุ้มเปลือกมีเยื่อหุ้ม chorioallantoic ที่ปลายทื่อของไข่มันจะผ่านไปด้านในของเยื่อหุ้มเปลือกที่ปิดช่องอากาศ เยื่อหุ้มนี้อุดมไปด้วยหลอดเลือดและทำหน้าที่เป็นอวัยวะทางเดินหายใจของตัวอ่อน จากด้านในจะมีช่องอัลลันโทอิกอยู่ติดกันซึ่งเป็นอวัยวะขับถ่ายและป้องกันตัวอ่อนไม่ให้แห้งและได้รับบาดเจ็บ โพรง allantoic ล้อมรอบตัวอ่อนซึ่งอยู่ในโพรงน้ำคร่ำซึ่งเต็มไปด้วยน้ำคร่ำ เอ็มบริโอจะเชื่อมต่อกับถุงไข่แดงซึ่งเป็นแหล่งสารอาหารหลักผ่านสายไข่แดง
เพื่อการเพาะเลี้ยงไวรัสที่ประสบความสำเร็จในร่างกายของการพัฒนาเอ็มบริโอไก่ จำเป็นต้องมีระบบอุณหภูมิที่แน่นอน (36 0 -38 0) ความชื้น (50-70%) และการระบายอากาศที่เพียงพอ ตัวอ่อนไก่ในช่วงอายุหนึ่งจะติดเชื้อ โดยฟักตัวเป็นเวลา 6 ถึง 13 วัน ขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัสและวิธีการติดเชื้อ มีความจำเป็นต้องเตรียม: ที่วางไข่, ขวดแอลกอฮอล์และไอโอดีน, หลอดทดลองที่มีพาราฟินปลอดเชื้อ, สลิปปิด, ถุงสำลีและผ้ากอซปลอดเชื้อ, ภาชนะปลอดเชื้อห่อด้วยกระดาษ, กระบอกฉีดยาปลอดเชื้อ, เข็ม, แหนบ, เข็มผ่า เครื่องมือจะถูกใส่ไว้ในแก้วแอลกอฮอล์ซึ่งจะคงอยู่ตลอดงาน ก่อนการจัดการแต่ละครั้ง อุปกรณ์จะถูกฆ่าเชื้อเพิ่มเติมด้วยการยิงในเปลวไฟจากเตา ล้างมือให้สะอาดก่อนทำงานแนะนำให้สวมหน้ากากผ้ากอซ
คัดเลือกเอ็มบริโอที่มีชีวิตเพื่อทำงานโดยการตรวจไข่ที่ฟักแล้วในการส่องกล้อง ตัวอ่อนที่มีชีวิตจะเคลื่อนที่ได้ หลอดเลือดของเยื่อหุ้มเซลล์จะเต็มไปด้วยเลือด ไข่ที่เลือกไว้จะได้รับการฆ่าเชื้ออย่างทั่วถึงที่ปลายทู่ (หรือด้านข้างของไข่): เช็ดเปลือกด้วยแอลกอฮอล์ หล่อลื่นด้วยไอโอดีน ชุบแอลกอฮอล์อีกครั้งแล้วเผา
1.3.2. การติดเชื้อของตัวอ่อนลูกไก่บนเยื่อหุ้มเซลล์ chorioallantoic
ใช้ตัวอ่อนไก่อายุ 10-12 วันในการติดเชื้อ ระยะหลักของการติดเชื้อ:
1. วางไข่บนขาตั้งในแนวตั้งโดยให้ถุงลมอยู่ด้านบน และเปลือกจะถูกฆ่าเชื้อที่ปลายทื่อของไข่
2. เจาะเปลือกเหนือตรงกลางถุงลมโดยใช้เข็มผ่า
3. ใส่กรามของกรรไกรเข้าไปในรูที่เกิดและตัดหน้าต่างที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1.5 ซม. เข้าไปในเปลือก
4. ผ่านรูฉีกใบด้านในของเปลือกด้วยเข็มอย่างระมัดระวังแล้วลอกออกในพื้นที่เล็ก ๆ (0.5-1 ซม. 2)
5. เยื่อหุ้ม chorioallantoic ติดเชื้อโดยการใช้วัสดุที่มีไวรัส 0.1-0.2 มิลลิลิตรโดยใช้ปิเปตหรือเข็มฉีดยาของปาสเตอร์
6. หน้าต่างในเปลือกหุ้มด้วยฟิล์มยืดหยุ่นพิเศษหรือกระจกครอบที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วติดด้วยพาราฟินหลอมเหลว
ตัวอ่อนที่ติดเชื้อจะถูกวางไว้ในเทอร์โมสตัทในตำแหน่งแนวตั้งและฟักตัวเป็นเวลา 2-3 วัน หลังจากนั้นจึงทำการชันสูตรพลิกศพตามกฎต่อไปนี้:
1. วางไข่บนขาตั้งเพื่อให้พื้นที่อากาศอยู่ด้านบน และพื้นที่เปิดฆ่าเชื้อ
2. ใช้กรรไกรปลอดเชื้อตัดเปลือกออกตามขอบช่องอากาศ
3. ใช้แหนบดึงเปลือกตามขอบออก เยื่อหุ้มเซลล์ chorioallantoic ที่ถูกเปิดเผยจะถูกตัดแต่งตามขอบของเปลือก เทเนื้อหาทั้งหมดของไข่ลงในถ้วยหรือถาดผ่านรูที่เกิดขึ้น
4. เมมเบรน chorionallantoic ที่เหลืออยู่ภายในเปลือกจะถูกเอาออกอย่างระมัดระวังด้วยแหนบและวางลงในถ้วยที่ปราศจากเชื้อด้วยน้ำเกลือ ที่นี่พวกเขาปรับให้ตรงและศึกษาการเปลี่ยนแปลงโดยวางถ้วยไว้บนพื้นหลังสีเข้ม
เพื่อให้ได้วัสดุที่มีไวรัสจากเยื่อหุ้มเซลล์ choionallantoic จะต้องบดด้วยกรรไกรแล้วบดในครกด้วยแก้วควอทซ์โดยเติมน้ำเกลือ สารแขวนลอยที่ได้จะถูกปั่นแยกที่ 2,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10-15 นาที และส่วนเหนือตะกอนจะถูกใช้เป็นวัสดุที่มีไวรัส
ข้าว. 3.การติดเชื้อของตัวอ่อนไก่
1.3.3. การติดเชื้อในช่องอัลลันโทอิก
ตัวอ่อนอายุ 10-11 วันจะถูกนำไปติดเชื้อ ระยะหลักของการติดเชื้อ:
1. วางไข่ไว้บนขาตั้งโดยให้ปลายทู่หงายขึ้น และเปลือกไข่จะถูกฆ่าเชื้อเหนือช่องอากาศ
2. การเจาะเปลือกเกิดขึ้นที่กึ่งกลางของปลายทู่โดยใช้เข็มผ่า
3. สอดเข็มของกระบอกฉีดยาที่มีสารเจือจางของไวรัสเข้าไปในรู เข็มจะเคลื่อนไปในแนวตั้งต่ำกว่าระดับถุงลม 2-3 มม. จากนั้นจึงฉีดสารปริมาณ 0.1-0.2 มิลลิลิตร
4. รูในเปลือกถูกปิดผนึกด้วยพาราฟินที่ผ่านการฆ่าเชื้อที่ละลายแล้ว
โดยปกติตัวอ่อนที่ติดเชื้อจะถูกเก็บไว้ในเทอร์โมสตัทเป็นเวลา 2 วัน ก่อนเปิดไข่จะถูกวางไว้ในตู้เย็นข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 0 C การเปิดจะดำเนินการตามลำดับต่อไปนี้:
1. วางไข่บนขาตั้งโดยให้ถุงลมอยู่ด้านบน เปลือกด้านบนฆ่าเชื้อแล้ว
2. ใช้กรรไกรตัดเปลือกออกเหนือขอบของช่องอากาศเล็กน้อย
3. ถอดเมมเบรนของเปลือกออกอย่างระมัดระวังด้วยแหนบ หลังจากนั้นจึงเจาะเมมเบรน chorioallantoic ด้วยปิเปตของปาสเตอร์ในบริเวณที่ไม่มีภาชนะและของเหลว allantoic จะถูกดูดเข้าไป
4. ของเหลวอัลลันโทอิกจะถูกถ่ายโอนไปยังหลอดทดลองที่ปราศจากเชื้อ และส่วนหนึ่งของของเหลวจะถูกฉีดเข้าไปในน้ำซุปเพื่อทดสอบความเป็นหมันทางแบคทีเรีย
