Scopul lecției
Familiarizarea elevilor cu metodele de selectare a embrionilor de pui pentru cultivarea virusurilor.
Echipamente și materiale
Embrioni de pui 9-12 zile de incubație, ovoscop, tampoane cu alcool, suporturi pentru embrioni, pensete, foarfece, bandă adezivă, ace, seringi, creioane, perforatoare, ace, tabele, diagrame, echipament multimedia, prezentări MS Office Power Point pe tema lecției.
Metodologia de desfășurare a lecției și îndrumări pe tema
Explicația profesorului
Cultivarea virusurilor pe embrioni de pui este cea mai accesibilă și convenabilă metodă pentru izolarea primară a virusului. Practica utilizării acestei metode de infecție a arătat o serie de avantaje față de alte metode. Pentru infecție se folosesc embrioni de 5-12 zile de incubație.
AVANTAJE ȘI DEZAVANTAJE ALE embrionilor de pui ca OBIECTE BIOLOGICE
Cultivarea virusurilor în embrionii de pui este cea mai accesibilă și convenabilă metodă atât pentru izolarea primară a virusurilor de la animalele bolnave și de la obiectele din mediu, cât și pentru cultivarea ulterioară a virusurilor în laborator. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru identificarea virusurilor și anticorpilor, precum și pentru prepararea vaccinurilor și diagnosticelor. Practica a arătat o serie de avantaje ale acestei metode față de cultivarea virusurilor la animalele de laborator. Se știe că șoarecii albi, care sunt utilizați pe scară largă în studiile virologice, pot fi infectați spontan cu o serie de infecții virale: ectromelia, coriomeningita limfocitară, encefalita Taylor, pneumonia virală, virusul Sendai și altele, ceea ce complică extrem de mult munca și duce adesea. la concluzii eronate la aprecierea rezultatelor obţinute.rezultate. Cultivarea virușilor pe embrioni de pui elimină în mare măsură dificultățile de mai sus. Odată cu aceasta, se poate obține o cantitate semnificativ mai mare de virus dintr-un embrion de pui decât de la animalele de laborator. Embrionul de pui are o viabilitate mai mare și rezistență la diferite tipuri de influențe care sunt inevitabile atunci când este introdus materialul de testat. Cu o pricepere cunoscută în lucrul cu embrioni și respectarea regulilor de asepsie, moartea lor este nesemnificativă. Cea mai mare risipă de embrioni apare atunci când materialul este introdus în cavitatea amniotică și în sacul vitelin, dar nici în aceste cazuri nu depășește 10–15% dacă sunt îndeplinite condițiile de incubație necesare.
Embrionii de pui ca sistem viu au intrat în practica virologică în anii 30 ai secolului XX. Utilizarea lor a extins gama de virusuri cultivate în laborator, făcând posibilă rezolvarea cu mai mult succes a problemelor cu care se confruntă virusologia datorită faptului că embrionii de pui au o serie de avantaje față de animalele de laborator: 1) membrana învelișului și a subcochiliei protejează în mod fiabil embrion din infecția bacteriană din mediul extern; 2) un avantaj important al embrionilor este și sensibilitatea lor ridicată la o gamă largă de viruși, ceea ce se explică prin dezvoltarea insuficientă a mecanismelor de protecție; 3) embrionii de pui sunt un obiect ușor accesibil datorită dezvoltării unei rețele largi de ferme și incubatoare de păsări; 4) embrionii de pui sunt economici și nu necesită îngrijire sau hrănire.
Principalele dezavantaje sunt: 1) incapacitatea de a garanta pe deplin sterilitatea acestui sistem viu, deoarece embrionii pot transporta viruși și alți agenți patogeni în conținutul lor (virusuri de bronșită infecțioasă a puiului, boala Newcastle, gripă, leucemie, chlamydia și micoplasmă). Prezența lor poate distorsiona rezultatele studiului; 2) embrionii de pui nu sunt sensibili la toți virusurile.
SCOPURI UTILIZĂRII EMBRIONILOR DE GĂIN
Embrionii de pui sunt utilizați în virologie în principal în aceleași scopuri ca și animalele de laborator, și anume:
– detectarea virusului activ prin biotest în materialul patologic;
– izolarea primară a virusului. Virușii care provoacă boli la păsări, precum și unii virusuri de mamifere, sunt izolați și cultivați eficient pe embrioni de pui;
– mentinerea virusurilor in laborator;
– titrarea virusurilor;
– acumularea virusului pentru cercetarea de laborator și obținerea de vaccinuri;
– ca obiect de testare în reacția de neutralizare.
CERINȚE PENTRU embrionii de pui
Ouăle trebuie obținute de la ferme care nu suferă de boli virale. Ouăle fertilizate, chiar și de la găini sănătoși clinic, pot conține diferite virusuri întâlnite la aceste păsări: boala de Newcastle, bronșita infecțioasă, laringotraheita infecțioasă, encefalomielita, parainfluenza-2, poliartrita, variola, arbovirusurile, adenovirusurile etc. Prezența acestor virusuri poate, pe de o parte, conduc la erori de diagnostic, iar pe de altă parte, pe baza fenomenului de interferență, la suprimarea reproducerii virusului localizat în proba de testat. Embrionii care nu contin virus, dar obtinuti de la pui infectati asimptomatic cu anumite virusuri, pot fi, de asemenea, mai putin sensibili sau complet insensibili la efectele unui virus dat datorita prezentei anticorpilor specifici obtinuti de la mama cu galbenusul. Pentru izolarea cu succes a virusului, este necesar ca puii ai căror embrioni sunt utilizați în muncă să nu fie vaccinați împotriva bolii al cărei agent cauzal este căutat. Cojile de ou trebuie sa fie nepigmentate si curate (nu pot fi spalate). Vârsta embrionului trebuie să corespundă metodei de infectare alese.
Pentru a asigura dezvoltarea normală a embrionilor în ouăle fertilizate în timpul perioadei de incubație, este necesar să se mențină o anumită temperatură și umiditate. Embrionii în curs de dezvoltare tolerează supraîncălzirea mult mai rău decât răcirea. Prin urmare, o defecțiune pe termen scurt (în câteva ore) a sistemului de încălzire nu dăunează prea mult. Pentru o pauză mai lungă este necesară încălzirea.
Ouăle pentru incubație au nevoie de acces liber la aer proaspăt, care intră prin orificii de ventilație. Ele trebuie să fie întotdeauna deschise. Un ou, după cum se crede în mod obișnuit, consumă 1 litru de oxigen pe zi, ceea ce nu este surprinzător dacă ne amintim de dezvoltarea rapidă a embrionului pe parcursul a 21 de zile de incubație. De aceea, ouăle nu trebuie așezate strâns unul peste altul, sau unul peste altul. Termostatele convenționale nu sunt potrivite pentru incubarea ouălor. Doar in cazuri de extrema necesitate pot fi folosite in aceste scopuri, dar in acelasi timp aerisiti-le frecvent si asezati un vas cu apa in interior pentru a asigura umiditatea necesara.
Ouăle depuse pentru incubare sunt examinate după 3-5 zile folosind o lampă specială de masă sau de mână (dacă ouăle nu sunt scoase din tava incubatorului) pentru a le selecta pe cele nefertilizate. Ouăle de Leghorn sunt cele mai convenabile pentru munca virologică, deoarece coaja lor albă subțire permite o vedere mai bună a conținutului. Ouăle care sunt nefertilizate sau care conțin embrioni morți sunt îndepărtate din incubator. Proporția de ouă fertilizate variază foarte mult în funcție de mulți factori, inclusiv de perioada anului: primăvara este cea mai mare, iarna este cea mai scăzută.
Embrionii sunt scanați pentru a doua oară în ziua infecției planificate. Această perioadă depinde de tipul de virus, precum și de calea introducerii acestuia. Locul infecției este marcat pe coajă cu un creion obișnuit (nu cu cerneală).
STRUCTURA embrionului de pui
De obicei, o găină depune un ou fertilizat în care embrionul este în stadiul de blastula sau gastrula timpurie. Când oul este încălzit la o temperatură apropiată de temperatura corpului puiului, are loc dezvoltarea ulterioară a embrionului (Fig. 15). În perioada de la a 5-a până la a 12-a zi de incubație, embrionii de pui pot fi utilizați pentru infectarea cu viruși.
Figura 15 - Secțiune schematică a unui embrion de pui în a 8-a zi de incubație: 1 – coajă; 2 – membrana subshell; 3 – membrana corioalantoidiană; 4 – cavitatea alantoidiană; 5 – sacul vitelin; 6 – proteine; 7 – camera de aer; 8 – corpul embrionului; 9 – cavitatea amniotică
Un ou cu un embrion de pui în curs de dezvoltare este acoperit la exterior cu o coajă tare, poroasă, pe care membrana subcochilie se potrivește strâns. Acesta din urmă, la capătul tocit al oului, este împărțit în două frunze, între care se formează o cameră de aer. Corpul embrionului se află excentric în ou, cu spatele mai aproape de coajă, iar capul îndreptat spre camera de aer. Embrionul este scufundat în lichidul amniotic care umple cavitatea amniotică și este legat de gălbenuș prin cordonul ombilical. Gălbenușul este, de asemenea, situat excentric și relativ la embrion, parcă pe cealaltă parte a axei longitudinale.
Direct sub membrana cochiliei există o cavitate alantoidiană, care acoperă amnionul și sacul vitelin, iar până în ziua a 10-11 este închisă în capătul ascuțit al oului. În timpul dezvoltării, membrana alantoidiană fuzionează cu corionul, formând o singură membrană corioalantoidiană (CAO). La capătul ascuțit al oului se află restul proteinei.
Infecția într-una sau alta parte a embrionului se efectuează în perioada de dezvoltare maximă, când numărul de celule sensibile este cel mai mare.
În timpul procesului de incubație, dimensiunea structurilor embrionare se modifică, ceea ce se explică în mare parte prin scopul lor funcțional și determină vârsta optimă a embrionului pentru infectare.
Astfel, sacul vitelin ca rezervor de nutrienți are cel mai mare volum la începutul incubației, iar apoi (după a 12-a zi) pe măsură ce embrionul se dezvoltă, acesta scade. Infectează sacul vitelin din a 5-a până la a 7-a zi de incubație.
Cavitatea amniotică, fiind un mediu tampon pentru dezvoltarea embrionului, o acoperă deja în a 5-a zi de incubație. Cantitatea medie de lichid la mijlocul perioadei de incubație este de aproximativ 1 ml.
Pentru infecția în cavitatea amniotică, se folosesc embrioni în vârstă de 6-10 zile.
Cavitatea alantoică servește la colectarea produselor metabolice; în ea se acumulează săruri de acid uric, fosfor și azot. În timpul creșterii și dezvoltării embrionului, lichidul alantoic devine acid. Cavitatea alantoidiană atinge dimensiunea maximă în ziua 9-12 de dezvoltare a embrionului, prin urmare infecția în cavitatea alantoică se efectuează în principal în ziua 9-11 de incubație.
Membrana corioalantoică este bogată în vase de sânge, care, în apropierea suprafeței interioare a învelișului poros, sunt saturate cu oxigen și îl furnizează corpului embrionului, îndeplinind funcția organului respirator al embrionului. CAO atinge dezvoltarea maximă în ziua 11-13. Infecția membranei corioalantoice se realizează în a 10-12-a zi de incubație.
PREGĂTIREA embrionilor de pui pentru infecție
Embrionii sunt transportați din incubator fără a fi răciți pe drum. În laborator, embrionii sunt incubați într-un termostat la o temperatură de 37 °C și o umiditate de 60-70%, care se realizează prin plasarea vaselor deschise cu gât larg cu apă în termostat. Orificiile termostatului trebuie să fie deschise. Embrionii sunt plasați cu camera de aer în sus în standuri speciale. Se recomandă să se permită embrionilor să se adapteze la noile condiții în decurs de 24 de ore înainte de infectare și să își normalizeze funcțiile după stresul de transport. Dacă laboratorul are propriul incubator, atunci ouăle fertilizate depuse de pui sunt potrivite pentru depunerea acolo în termen de 10 zile.
Pregătirea embrionilor de pui pentru infecție include ovoscoparea și dezinfectarea cochiliei, precum și pregătirea adecvată a locului de muncă. Ovoscoparea implică vizualizarea ouălor împotriva unei surse de lumină suficient de strălucitoare (ovoscop), în urma căreia se formează umbre din structurile interne pe partea neluminată a cochiliei (Fig. 16). Ovoscoparea se efectuează într-o cameră întunecată. Totodată, pe coajă, cu un creion de grafit, se marchează marginea camerei de aer, locația embrionului și o secțiune a zonei avasculare de 0,5x0,5 cm.Aceste semne servesc ca ghid la alegere. site-ul de introducere a materialului care conține viruși. În timpul ovoscopiei, se determină, de asemenea, dacă embrionul este viu sau mort. Embrionii care prezintă mișcări active cu o bună alimentare cu sânge a vaselor CAO sunt considerați vii.
Figura 16 - Ovoscoparea unui embrion de pui în a 10-a zi de incubație. Umbrele sunt vizibile: 1 – embrion; 2 – sacul vitelin; 3 – vasele de sânge XAO; 4 – camera de aer; 5 – veveriță
Embrionii de pui sunt infectați în condiții aseptice (de preferință într-o cutie). În prebox, cochiliile embrionului sunt tratate cu alcool iodat, apoi în cutie sunt șterse din nou, iar uneori sunt și flambate - tratate cu flacăra unui tampon umezit cu alcool.
Embrionii sunt fixați în suporturi speciale instalate într-o cuvă de smalț pe o cârpă de tifon cu 3-4 straturi umezită cu o soluție dezinfectantă.
Lucrarea folosește unelte sterilizate prin fierbere. Se pun într-un borcan cu alcool și se ard cu o flacără de arzător înainte de fiecare reutilizare.
Demonstrație
a) semne clinice de boală la animalele de laborator infectate; b) metode de ucidere a animalelor de laborator; c) tehnici de autopsie (atrage atenția elevilor asupra stării organelor interne) și metode de obținere a materialului care conține virusuri; d) tehnici de realizare a amprentelor cerebrale; e) actiuni de dezinfectare a locului de munca si a cadavrului dupa autopsia unui animal infectat.
Sarcini
1.Studiați structura unui embrion de pui.
2. Efectuați o ovoscopie a unui embrion de pui, determinați viabilitatea acestuia și marcați limitele umbrelor formațiunilor naturale.
3. Pregătiți embrionii de pui pentru infecție.
Munca independentă a elevilor
a) recunoașterea șoarecilor infectați de fiecare elev prin semn de culoare, analiza stării lor clinice, uciderea, fixarea într-o cuvă cu fund de ceară (parafină), disecția; b) analiza modificărilor patologice, obținerea de material care conține virus (organe parenchimatoase), pregătirea de amprente cerebrale strat cu strat.
Elevii efectuează o ovoscopie a unui embrion de pui, determină viabilitatea acestuia și marchează limitele umbrelor formațiunilor naturale.
Rezumând lecția
Temă pentru următoarea lecție
Întrebări de control
1. Structura unui embrion de pui.
2. De ce sunt folosiți embrionii de pui în virologie?
3. Care este structura unui embrion de pui în curs de dezvoltare?
Scopul lecției: pentru a familiariza elevii cu metodele de infectare a embrionilor de pui pentru cultivarea virusurilor.
Echipamente si materiale: embrioni de pui 9-12 zile de incubație, ovoscop, tampoane cu alcool, suporturi pentru embrioni, pensete, foarfece, bandă adezivă, ace, seringi, creioane, perforatoare, ace, tabele, diagrame, echipament multimedia, prezentări MS Office Power Point pe tema lecției.
Explicația profesorului.
Metoda de infectare afectează semnificativ reproducerea virusurilor în embrioni. Înainte de infectare, ouăle incubate sunt lumânate, iar cele moarte sunt separate. Pe cojile ouălor cu embrioni vii, care se disting prin culoarea roșie a vaselor de sânge și mișcarea embrionului, locul infecției este marcat cu un creion.
Embrionii sunt infectați într-o cutie sterilă cu o masă de lucru, două scaune, alimentare cu gaz, alimentare cu apă și vid. Infecția în cavitatea amniotică se efectuează într-o cameră întunecată. Locul de muncă ar trebui să fie bine iluminat. Înainte de muncă, masa este dezinfectată. Pentru a dezinfecta suprafața ouălor, se pregătește o soluție antiseptică (70% alcool, 2% soluție de iod) și un băț de lemn învelit în vată, o sondă dentară îndoită sau un burghiu pentru găurirea prin coaja de ou. Ouăle sunt infectate folosind seringi sterile pentru tuberculinizare și ace speciale. Locul de infectare de pe ou este umplut cu parafină. Pentru a face acest lucru, se prepară bețișoare de parafină: se introduce o tijă de sticlă într-o eprubetă umplută cu parafină topită, asigurându-se că se află în centrul eprubetei până când parafina se răcește.
Când este nevoie de un bețișor de parafină, pereții eprubetei sunt încălziți pe un arzător și parafina este scoasă din eprubetă folosind o baghetă de sticlă. Ținând bățul deasupra flacără, topiți cantitatea de parafină necesară pentru a închide orificiul din ou. Această metodă este foarte curată și nu produce vapori de parafină.
În plus, se așează pe masa de lucru într-o cutie un pahar cu tampoane de vată sterile, un pahar cu o soluție de 3% de sodă caustică pentru instrumentele uzate și un vas cu o soluție de cloramină pentru obiectele din sticlă uzate. Dacă este necesar, puteți pregăti o cupă de ouă, o ceașcă mică emailată și medii de cultură sterile. Masa de lucru astfel pregătită este supusă la iradiere UV timp de 1-2 ore.
Având în vedere patogenitatea virusurilor studiate, se lucrează purtând mască, mănuși de cauciuc și ochelari de protecție.
Există șase metode de infectare a embrionilor. Infecția în cavitatea alantoică și membrana corioalantoică este cel mai des utilizată, mai rar în cavitatea amniotică și în sacul vitelin și foarte rar în corpul embrionului și în vasele de sânge ale CAO. Alegerea metodei este determinată de tropismul virusului, precum și de scopul infecției. Pentru orice metodă de infecție se injectează 0,1-0,2 ml de material infecțios.
Infecție în cavitatea alantoică.
Când sunt infectate prin această metodă, se înmulțesc bine virusurile gripale, boala Newcastle, rinoneumonia ecvină, stomatita veziculoasă etc.. Există mai multe variante ale metodei.
Prima varianta. Embrionul este fixat vertical cu capătul contondent în sus. O gaură cu un diametru de aproximativ 1 mm se face în cochilie pe partea embrionului, iar uneori pe partea opusă embrionului, la 5-6 mm deasupra marginii camerei de aer. Acul se introduce paralel cu axa longitudinală până la o adâncime de 10-12 mm (Fig. 16). După injectarea materialului care conține virus, acul este îndepărtat și orificiul din înveliș este închis cu o picătură de parafină sterilă topită.
Figura 16. Infecția în cavitatea alantoidiană (prima opțiune) (după Nikolaou)
A doua varianta. Gaura făcută în carcasă deasupra camerei de aer este folosită doar pentru a permite o parte din aer să iasă. Gaura pentru infecția în sine este făcută în zona zonei avasculare a membranei corioalantoice (CAO) pe partea laterală a embrionului. Acul este introdus la o adâncime de cel mult 2-3 mm. Se injectează un lichid infecțios într-un volum de 0,1-0,2 ml și se închide orificiul cu parafină (vezi Fig. 17).
Infecția membranei corioalantoide.
Această metodă de infectare a embrionilor de pui este adesea folosită pentru cultivarea virusurilor epiteliotrope și pantropice ale variolei, laringotraheita infecțioasă a păsărilor, boala Aujeszky, limba albastră etc.
O astfel de infecție poate fi realizată printr-o cameră de aer naturală sau artificială.
Pentru infecție printr-o cameră de aer naturală embrionul este așezat vertical pe un trepied cu capătul contondent în sus și se decupează în carcasă o fereastră rotundă cu diametrul de 15-20 mm pe centrul camerei de aer. Prin această fereastră, membrana subshell este îndepărtată cu o pensetă. Pe zona expusă a CAO se aplică 0,2 mm de suspensie care conține virus (Fig. 18), orificiul este închis cu un tencuială adeziv sau, mai rar, cu o sticlă de acoperire, întărită cu parafină topită.
Infecţie printr-o cameră de aer artificială este utilizat mai des decât primul, deoarece asigură contactul materialului care conține virusul cu o suprafață mai mare a CW și, prin urmare, duce la formarea unei cantități mai mari de virus.
Figura 17. Infecția unui embrion de pui în cavitatea alantoidiană (a doua opțiune) (conform lui Nikolaou)
Figura 18. Infecția la KhAO printr-o cameră de aer naturală (după Nikolaou și colab.)
Figura 19. Infecția unui embrion de pui la KhAO printr-o cameră de aer artificială (conform Nikolaou și colab.)
Pentru a infecta un embrion prin această metodă, acesta este plasat orizontal într-un suport, cu embrionul în sus. În cochilie se fac două găuri: una mică deasupra centrului camerei de aer (destinată să aspire aer din aceasta), iar cealaltă cu un diametru de 0,2-0,5 cm pe lateral, pe partea embrionului. Complexitatea metodei este că atunci când faceți cea de-a doua gaură, trebuie mai întâi să îndepărtați cu atenție o bucată de carcasă, apoi cu o mișcare de alunecare, fără a deteriora substanța chimică, mutați carcasa în lateral, astfel încât aerul să poată trece prin rezultatul. defect. După aceasta, aerul este aspirat din camera de aer naturală folosind un bec de cauciuc prin primul orificiu (Fig. 19, a) Ca urmare, prin orificiul lateral, aerul exterior se precipită înăuntru, formând o cameră de aer artificială, partea inferioară. dintre care este XAO (Fig. 19, b).
Prin orificiul lateral, un lichid infecțios este aplicat pe suprafața CAO și orificiul este închis cu o bucată de bandă adezivă. Nu este nevoie să închideți prima gaură, deoarece stratul interior al membranei cochiliei nu este deteriorat de această metodă de infecție și continuă să acționeze ca o barieră pentru microflora mediului.
Incubarea ulterioară a embrionilor infectați prin această metodă se efectuează în poziție orizontală, cu deschiderea laterală în sus.
Infecție în sacul vitelin.
În cea mai mare parte, este utilizat pentru propagarea chlamydia, precum și virușii bolii Marek, rinoneumonie ecvină, limba albastră a oilor etc. Infectează embrioni de 5-7 zile și uneori de 2-3 zile (RIF). virusul febrei văii). Sunt utilizate două opțiuni de infectare.
Prima varianta. Embrionii sunt plasați într-un trepied în poziție verticală. Se face o gaură în înveliș deasupra centrului camerei de aer și se introduce un ac la o adâncime de 3,5-4 cm la un unghi de 45° față de axa verticală în direcția opusă locației embrionului (Fig. 20).
Figura 20. Infecția unui embrion de pui în sacul vitelin (conform lui Nicolaou și colab.)
A doua varianta. Uneori, o cale similară de infecție este efectuată pe un embrion montat orizontal într-un trepied; în acest caz, embrionul este în partea de jos, iar gălbenușul este deasupra. Orificiul din carcasă se închide cu o picătură de parafină topită.
Infecție în cavitatea amniotică.
În acest scop, se folosesc embrioni de 6 până la 10 zile. Metoda este folosită pentru cultivarea virusurilor gripale, boala Newcastle, rinoneumonia ecvină etc. Există două metode de infectare.
Metoda închisă. Infecția se efectuează într-o cutie întunecată. Oul este plasat pe ovoscop în poziție orizontală, cu embrionul în sus. Un ac cu capătul contondent este introdus printr-o gaură din carcasă deasupra camerei de aer spre embrion. Dovada că acul a pătruns în amnios este mișcarea corpului fetal în direcția mișcării.
Metoda deschisă.Învelișul de deasupra camerei de aer este tăiat astfel încât să se formeze o fereastră cu diametrul de 1,5-2,5 cm.Prin ea se îndepărtează membrana subcocilă cu pensete sub controlul ochiului. Apoi se ghidează penseta anatomică (14 cm) cu fălcile închise, împingând membrana corioalantoidiană spre embrion. Când penseta ajunge la el, fălcile se deschid, apucă membrana amniotică împreună cu CAO și trage-o spre fereastră. Ținând penseta cu membrana amnionică fixată în ea cu mâna stângă, se introduce un material care conține virus (Fig. 21). Apoi, toate membranele sunt coborâte, fereastra este închisă cu un tencuială adeziv, iar embrionul este incubat în poziție verticală.
Figura 21. Infecția unui embrion de pui în amnios folosind metoda deschisă (conform lui Nikolaou și colab.)
Infecție în vasele de sânge ale XAO.
Când se ovoscopează embrioni de 11-13 zile, se observă un vas de sânge mare. Pe măsură ce progresează, o secțiune a cochiliei este îndepărtată, se aplică 1-2 picături de alcool, ceea ce face membrana cochiliei transparentă pentru un timp. Sub controlul ochilor cu ajutorul unui ovoscop, acul este introdus în vas, ceea ce este confirmat de mobilitatea sa cu mici mișcări laterale ale acului. Zona expusă a membranei subshell este acoperită cu o bucată de ipsos adeziv.
Materialul poate fi introdus și în vase într-un mod ușor diferit: învelișul de deasupra camerei de aer este tăiat, membrana subcarcată este umezită cu alcool, iar materialul este introdus în vasele XAO care au devenit vizibile. Orificiul este acoperit cu o bucată de bandă adezivă sterilă.
Metodele tehnice descrise pentru infectarea experimentală a embrionilor de pui nu sunt singurele, dar au diverse opțiuni.
Infecția în corpul embrionului.
Embrionii de 7-12 zile sunt utilizați pentru infecție. Există două versiuni cunoscute ale metodei.
Prima varianta. Se infectează la fel ca la amnios în mod închis, cu singura diferență că iau un ac ascuțit și pe un ovoscop, indicatorul pătrunderii acului în corp este considerat a fi subordonarea embrionului față de mișcări. a acului.
A doua varianta. Ei infectează amnionul în același mod ca și în mod deschis: printr-o fereastră din coajă, corpul embrionului este tras în sus cu o pensetă. Materialul este injectat în creier sau în anumite zone ale corpului. Cu astfel de metode de infecție, există un procent semnificativ de moarte embrionară nespecifică.
Acumularea virusului în embrionul de pui
Înainte de continuarea incubației, pe coaja embrionilor de pui infectați prin orice metodă, ei scriu cu un creion simplu (grafit) cu ce este infectat embrionul și când, și dacă este necesar, alte informații. Embrionii de pui infectați sunt plasați într-un termostat pentru incubare ulterioară, timp în care virusurile introduse sunt reproduse și acumulate în structurile corespunzătoare. Temperatura de incubație a embrionilor variază de la 33 la 38 °C, în funcție de proprietățile virusului cu care a fost efectuată infecția. Embrionii sunt monitorizați în mod constant, examinați pe un ovoscop, iar cei morți sunt selectați.
Moartea embrionilor în primele 24 de ore după infecție se datorează cel mai adesea proliferării ciupercilor, microflorei bacteriene introduse în embrion împreună cu inoculul sau rănirii în timpul infecției. Acest deces este considerat nespecific. La o dată ulterioară, embrionii mor ca urmare, de regulă, a înmulțirii virusului în embrioni. După ce au descoperit embrioni morți, aceștia sunt imediat transferați într-un frigider la o temperatură de 4 °C. Astfel de condiții, pe de o parte, contribuie la păstrarea activității virusului acumulat în embrion, pe de altă parte, la compactarea țesuturilor și golirea vaselor de sânge, ceea ce facilitează foarte mult disecția ulterioară.
Embrionii sunt incubați până când apare acumularea maximă a virusului. Pentru fiecare virus și chiar tulpină, această perioadă este specifică și variază de la 2 la 7-8 zile. Astfel, pentru tulpina H de virus al bolii Newcastle este de 2-3 zile, pentru aceeași tulpină de virus B - 5 zile, pentru virusul laringotraheitei infecțioase aviare - 5 zile etc. Apoi toți embrionii sunt uciși prin răcire la 4 ° C pt. cel putin 3-4 ore si deschis.
Ouă deembrinate.
Metoda se bazează pe îndepărtarea embrionului din ou în perioada în care membrana corioalantoică este complet adiacentă cochiliei din interior. Dacă în interiorul unui astfel de ou se adaugă un mediu nutritiv, se formează un fel de cultură tisulară în care virusul se poate multiplica. Metoda are o serie de avantaje: permite obținerea unui virus mai pur decât în lichidul alantoico-amniotic, ceea ce este important pentru reducerea proprietăților alergene ale vaccinurilor preparate din acest material; Absența sacului vitelin și, prin urmare, a anticorpilor specifici conținuti în acesta permite unor virusuri să se înmulțească mai bine. În unele cazuri, această metodă dă rezultate bune în munca de diagnosticare, deoarece poate introduce cantități mari de material de testat, ceea ce crește posibilitatea izolării virusului.
Metoda a fost propusă de Bernkopf încă din 1949, dar din cauza dificultăților de aplicare nu este utilizată pe scară largă. Aceste dificultăți sunt asociate cu proprietatea membranei corioalantoice de a se separa de coajă în timpul incubației, ceea ce reduce valoarea culturii și complică manipularea obținerii virusului și înlocuirii mediului nutritiv.
E. Groiel (1963) a introdus o serie de modificări care au eliminat aceste dificultăţi. El a sugerat să se folosească ouă de 15 zile sau chiar mai vechi, care ar trebui să fie întoarse frecvent în timpul incubației pentru a asigura o dezvoltare uniformă a cojii pe coaja ouălor. Când este transiluminat, sunt indicate limitele camerei de aer. Coaja este tăiată cu ferăstrăul la 0,5 cm deasupra acestei linii, parafină topită (56-58 C°) este turnată pe marginea cochiliei, care se întărește și fixează marginea oului. Apoi, o gaură rotundă este tăiată în membrana deasupra embrionului, lăsând o margine îngustă în jurul acestuia. Următorul pas este îndepărtarea cu grijă a embrionului din ou. În acest caz, oul trebuie ținut în poziție orizontală și rotit încet. În acest fel, vasele care leagă embrionul cu CAO sunt găsite și tăiate cu foarfecele. Dacă oul este ținut vertical, atunci embrionul cu masa sa trage înapoi coaja, de obicei rupând-o în zona capătului ascuțit al oului. Pătrunderea chiar și a unei cantități mici de lichid între substanțele chimice și cochilie determină desprinderea completă a cochiliei în 1-2 zile.
După îndepărtarea embrionului, membrana care căptușește oul este spălată de mai multe ori cu soluție salină răcită la 4-0°C până când lichidul devine limpede. Apoi se introduc 20 ml de mediu nutritiv încălzit la 37 ° C în cavitatea oului, iar oul este închis cu un capac steril de cauciuc, scufundandu-l în prealabil în parafină. Un tub cu dop de cauciuc încorporat în ou permite atât colectarea, cât și administrarea lichidului fără riscul contaminării bacteriene. Un astfel de obiect biologic rămâne viabil timp de câteva zile.
Conform metodei lui Yoshino și alții, cavitatea ouălor deembrinate este umplută cu o soluție de agar în soluția lui Hanks. Ouăle deembrinate sunt infectate printr-un tub din capac.
Întrebări de control:
1. Structura unui embrion de pui.
2. De ce sunt folosiți embrionii de pui în virologie?
3. Care este structura unui embrion de pui în curs de dezvoltare?
Izolarea virusurilor la animalele de laborator.
Alegerea animalelor de laborator depinde de tipul de virus. Animalele de laborator sunt un model biologic. Uneori, este necesar să se efectueze 3-5 pasaje „oarbe”, asimptomatice înainte de a fi posibilă adaptarea virusului la condițiile de laborator. Cu toate acestea, animalele de laborator nu sunt sensibile la unele virusuri, caz în care este necesar să se utilizeze animale susceptibile în mod natural. Ca, de exemplu, cu pesta porcină și anemie infecțioasă a cailor.
Scopul infectării animalelor de laborator:
1. Studiază patogeneza bolii;
2. Izolați virusul de materialul patogen;
3. Producția de seruri imune și hiperimune;
4. Producerea vaccinurilor;
5. Mentinerea virusilor in conditii de laborator;
6. Titrare, pentru a determina cantitatea de virus pe unitatea de volum;
7. Model biologic de stadializare a reacţiei de neutralizare;
Alegerea metodei de infectare a animalelor de laborator depinde de tropismul virusului. Astfel, la cultivarea virusurilor neurotropice, animalele sunt infectate în creier; respirator intranazal, intratraheal; dermatopic - subcutanat și intradermic.
Infecția se efectuează cu respectarea regulilor de asepsie și antiseptice.
Există multe modalități de a introduce material care conține virusuri în corpul animalelor:
Subcutanat; - intracerebral; - intradermic;
intraperitoneal; - intramuscular; - Intraocular;
intravenos; - intranazal; - nutritionala;
După infectare, animalele sunt marcate, plasate într-o cutie izolată și monitorizate timp de 10 zile. Moartea unui animal în prima zi după infectare este considerată nespecifică și nu este luată în considerare ulterior.
3 semne indică eficacitatea infecției:
Prezența semnelor clinice
Moartea unui animal
Modificări anatomopatologice (dimensiunea, forma, culoarea și consistența organului).
Un embrion de pui este un ou de gaina fertilizat in care se dezvolta un embrion (embrion). Cultivarea virusurilor pe embrioni de pui și prepeliță a devenit recent răspândită ca una dintre cele mai simple și mai fiabile metode de cultivare și diagnosticare a multor virusuri și a unor bacterii - Brucella, Rickettsia, Vibrio.
Mulți viruși umani și animale pot fi cultivați în embrioni de pui în curs de dezvoltare. Țesutul embrionar, în special membranele embrionului, bogat în țesuturi epiteliale germinale, este un mediu favorabil pentru proliferarea multor virusuri. Virușii cu proprietăți epiteliotrope (variola, ILT etc.) se dezvoltă cu succes pe membrana corioalantoidiană, provocând modificări vizibile macroscopic. Diferiți reprezentanți ai mixovirusurilor (gripa, boala Newcastle, ciurlia canină etc.), virusurile bronșitei infecțioase, hepatitele de rătușcă, arbovirusurile etc. se reproduc bine în embrion atunci când materialul este introdus în cavitatea alantoică. Unii virusuri pot fi cultivate cu succes în sacul vitelin.
Avantaje:
1. Rentabil din punct de vedere economic, în plus, ouăle sunt ușor disponibile;
2. Embrionii de pui în curs de dezvoltare lipsesc mecanisme de protecție, deoarece sistemul imunitar nu este încă dezvoltat;
3. Cojile de ou împiedică bacteriile și virușii din mediu să pătrundă prin ea;
Pentru a cultiva și izola virușii pe embrioni de pui, este necesar un echipament foarte simplu - un termostat obișnuit sau un incubator.
Conditii:
1. Ouăle sunt obținute din ferme cunoscute ca fiind lipsite de boli infecțioase;
2. Este mai bine să obțineți embrioni de pui din rase albe de pui (Leghorn, Russian White), deoarece sunt mai rezistenți la manipulare și nu mor din cauza rănilor minore. În plus, coaja lor este albă și mai transparentă decât cea a altor rase și este mai ușor de văzut, ceea ce este convenabil pentru vizualizare și observare în timp ce lucrați cu ele;
3. Pentru incubație, se selectează ouăle fertilizate depuse cu cel mult 10 zile în urmă;
4. Luați ouă necontaminate, deoarece acestea nu pot fi spălate înainte de incubare, iar ouăle murdare sunt mai puțin vizibile când sunt privite (ovoscopie) și când se lucrează cu ele, embrionul poate fi infectat în timpul procesului de manipulare;
Ouăle sunt incubate într-un incubator sau într-un termostat cu încălzire a apei și acces la aer, iar în timpul incubației în termostat, ouăle trebuie întoarse de 2-3 ori pe zi și, pentru un schimb mai bun de gaze, scoase timp de 5-10. minute în aer. Pentru a menține o anumită umiditate, un vas cu apă este plasat în termostat pentru evaporare; temperatura în termostat trebuie să fie de 38°.
Dezvoltarea embrionului are loc deja în prima zi de incubație, are loc depunerea creierului și a scheletului. Structura unui embrion de pui la vârsta de 7-9 zile(vezi caiet).
Pentru infecție, cel mai des sunt utilizați embrionii de 7-12 zile. Lucrarea cu embrionii de pui se desfășoară într-o cameră sterilă, cu cea mai strictă aderență la asepsie.
Scopul infectării embrionilor de pui este:
1. Izolați căptușeala de materialul brevetat;
2. Producerea vaccinurilor;
3. Mentinerea virusului intr-un laborator;
4. Titrarea virusurilor;
5. Model biologic de stadializare a reacţiei de neutralizare;
6. Studiul interferenței virusului și al producției de interferon; Infecția embrionilor de pui:
Pentru infecție, trebuie selectați embrioni viabili cu motilitate bine definită. Înainte de infectare, toți embrionii sunt examinați cu atenție într-o cameră întunecată folosind un ovoscop.
În timpul lumânării embrionilor înainte de infecție, o puga (cavitatea aerului), cursul vaselor de sânge mari și locul de prezentare a embrionului sunt conturate pe coajă cu un creion simplu, adică zona de pe coajă unde embrionul se află cel mai aproape de aceasta. Marcarea pugului, locul de prezentare a embrionului și cursul vaselor de sânge mari servesc apoi ca ghid atunci când se alege locul pentru introducerea materialului care conține virusul în momentul infecției.
Embrionii de pui selectați pentru infecție sunt transferați într-o cutie, unde sunt lucrați. Înainte de infectare, coaja de la locul introducerii materialului este tratată de două ori cu alcool iodat și arsă. Doza de infecție este de 0,1-0,2 cm.
În funcție de tipul de virus și de scopul infecției, există diferite Metode de introducere a materialului care conține viruși:
1) Infecția membranei corioalantoide , embrionii cu vârsta de 7-12 zile sunt utilizați pentru izolarea și cultivarea virusurilor neurotropice, dermatopice și a unor virusuri pantropice (variola, encefalomielita, ILT, febra aftoasă, rabia, ciuma etc.). Există 3 opțiuni de infectare:
a) deschideți puga și tăiați-o cu foarfecele, separați membrana subcochii și aplicați material pe membrana corioalantoidiană (CAO). Orificiul din ou este apoi sigilat cu un capac de sticlă steril și marginile capacului sunt ceruite;
b) tăiați un triunghi cu lungimea laterală de aproximativ 1 cm în cochilie cu o pilă cu ac (pilă) sau un bisturiu zimțat la marginea puja pe partea de prezentare a embrionului, îndepărtați secțiunea cochiliei și membrana substelară cu penseta și introduceți materialul. Orificiul este acoperit cu o sticlă de acoperire sterilă, iar marginile sunt parafinizate sau sigilate cu o bandă adezivă sterilă.
c) o zonă mică a cochiliei cu o suprafață de aproximativ 0,5 cm este îndepărtată cu un bisturiu în locul în care este prezentat embrionul, apoi membrana subcochilie este îndepărtată în această zonă folosind o pensetă sau un ac și materialul este injectat. Dacă materialul nu se potrivește bine în cavitatea oului, puteți folosi un bec de cauciuc pentru a pompa aerul din ou prin orificiul din coajă de pe ou și, ca urmare, se formează un ou artificial la locul unde este introdus materialul, iar apoi materialul este introdus ușor. Orificiul din carcasă este acoperit cu un tencuială adeziv sau cerat.
2) Infecție în cavitatea alantoică. Această metodă de infecție este foarte simplă și este folosită pentru a izola mulți viruși. Pentru infecție, se prelevează embrioni de 10-11 zile. Există două opțiuni de infectare:
a) infecția se realizează prin puga fără a o tăia. Cu ajutorul unui ac, măsurați distanța de la vârful pugii până la marginea pugii, marcată cu un creion pe coajă, și introduceți acul până la adâncimea marcată și adânciți încă 0,5 cm pentru a străpunge membrana corioalantoidiană;
b) materialul se introduce cu un ac printr-o puncție în cochilie la locul de prezentare a embrionului la o adâncime de 3-5 mm într-o zonă avasculară. Orificiul din carcasă este acoperit cu un tencuială adeziv sau cerat.
3) Infecție în sacul vitelin. Pentru infectare se folosesc embrioni de 5-8 zile. Există două opțiuni de infectare:
a) acul este introdus din partea pujei în sacul vitelin la un unghi de 45° față de locul de prezentare a embrionului sub controlul unui ovoscop;
b) oul este așezat pe suport cu punctul de prezentare a embrionului în jos și acul se introduce de sus în jos spre embrion la o adâncime de aproximativ 1 cm.
Locul de injectare este sigilat cu bandă adezivă și parafinizat. 4) Infecție în cavitatea amniotică. Cu această metodă de infecție, virusul poate pătrunde și se poate multiplica în diferite celule care sunt în contact cu lichidul amniotic. Pentru ușurința infecției, se recomandă incubarea embrionilor cu 2-3 zile înainte de infectare, cu pugul cu fața în sus. Apoi embrionul și amnionul se deplasează în sus și este mai convenabil să se infecteze. Există două opțiuni de infectare:
a) se deschide și se taie puga, se îndepărtează membrana subcochii cu penseta și se apucă amnionul, se trage amnionul cu penseta și se introduce material în doză de 0,1 ml în cavitatea amniotică. Orificiul din carcasă este apoi sigilat cu un capac de sticlă steril și marginile sunt ceruite;
b) infecție folosind un ac lung printr-un puga într-o cameră întunecată sub controlul ochilor.Vârful acului este mai întâi îndoit în unghi drept pentru a crea o zonă mică. Acul este introdus sub controlul ochiului prin protuberanța preembrionului; în acest caz, sub presiunea unui ac contondent, embrionul se va mișca, apoi amnionul este străpuns cu o ușoară împingere și acul este ușor. tras inapoi. În acest caz, embrionul ar trebui să se miște în sus în spatele acului. Apoi se introduce materialul.
5) Infecție în corpul embrionului și infecție în creier. Se folosesc embrioni de 7-12 zile, infecția se realizează prin introducerea materialului în diferite părți ale corpului sau direct în creier. Pentru infecție, puga este deschisă și embrionul este tras cu penseta. Cu aceste metode de infecție, până la 30% sau mai mult din numărul de embrioni infectați pot muri din cauza rănilor.
6) Infecție în vasele de sânge mari ale membranei corioalantoide. Această metodă de infecție, ca și cea anterioară, este folosită foarte rar. Materialul este injectat cu un ac subțire după îndepărtarea carcasei de-a lungul vasului de sânge direct în vas de-a lungul fluxului de sânge.
După infectare, embrionii de pui trebuie marcați cu un creion simplu și plasați într-un termostat. Ele sunt monitorizate zilnic prin vizionare, observarea se efectuează până la 7-8 zile, în funcție de tipul de virus. Dacă embrionii mor, aceștia sunt imediat scoși din termostat și introduși în frigider până la deschidere. Dacă embrionul moare în primele 14-18 ore, se poate datora leziunii sau toxicității materialului patologic. Prin urmare, la fel ca la infectarea animalelor de laborator, în cazurile îndoielnice se recomandă efectuarea mai multor treceri și luarea mai multor embrioni pentru fiecare material.
Autopsia embrionilor de pui infectați morți, sau a celor îndepărtați după expirarea perioadei de observație, se efectuează cu toate regulile de asepsie în condiții de box steril. Când este deschisă, coaja este tratată cu alcool și arsă, apoi puga este tăiată. Din embrionul deschis, lichidul alantoic este mai întâi aspirat cu atenție (cantitatea acestuia este de aproximativ 7 ml), apoi membrana amniotică este trasă înapoi cu penseta, străpunsă cu o pipetă Pasteur și lichidul amniotic este aspirat (cantitatea sa este de 1,0-). 1,5 ml), apoi se colectează gălbenușul, se îndepărtează membranele și se embrionează. Lichidul, membranele și embrionul însuși sunt examinate cu atenție pentru modificări. Lichidul amniotic este în mod normal complet limpede, dar atunci când este infectat poate fi tulbure și sângeroase. Modificările caracteristice provocate de virus sunt cele mai pronunțate pe membrana corioalantoidiană: apar focare inflamatorii, opace, de formă rotundă și hemoragii. Pe corpul embrionului pot apărea hemoragii. Tot materialul este colectat în recipiente sterile.
Embrionii de pui în virologie sunt folosiți pe scară largă nu numai pentru izolarea virusurilor, ci și pentru acumularea și obținerea de antigene, pentru prepararea de vaccinuri vii și ucise, titrarea virusurilor, pentru stadializarea unei reacții de neutralizare a virusului, pentru atenuarea (slăbirea) virusurilor, pentru studiul interferenței virusuri si obtinerea de interferon .
Izolarea și cultivarea virusurilor
Izolarea și identificarea agentului patogen este „standardul de aur” în diagnosticul infecțiilor virale.
Cultură de celule
Virușii se reproduc numai în celulele vii, iar izolarea agentului patogen într-o cultură de celule infectate este una dintre principalele metode de diagnosticare a infecțiilor virale. Deoarece majoritatea virusurilor patogenice se disting prin specificitatea de țesut și tip, este posibil să se selecteze culturi de celule sau țesuturi adecvate pentru aproape fiecare virus, precum și să se creeze condiții standard de cultivare (prezența celulelor de același tip). Reproducerea virusului este asigurată de celule sensibile (permisive). Prin urmare, atunci când un agent patogen necunoscut este izolat, 3-4 culturi celulare sunt infectate simultan, presupunând că una dintre ele poate fi permisivă. Culturile celulare se obțin prin dispersarea organelor și țesuturilor corespunzătoare, dar mai des folosesc țesuturi embrionare (umane și animale) sau celule tumorale transformate. Când sunt plasate pe o suprafață plană adecvată, culturile de celule cresc de obicei ca un monostrat.
Culturi primare tripsinizate. Suspensiile celulare se obțin prin omogenizarea țesuturilor corespunzătoare, pretratate cu tripsină. Culturile sunt adesea reprezentate de tipuri mixte de celule și nu pot fi re-cultivate. Viabilitatea unor astfel de culturi este de 2-3 săptămâni.
Linii celulare semi-continue reprezentată de celule diploide ale oamenilor și animalelor. Culturile au o adecvare limitată pentru redispersie și creștere (de obicei nu mai mult de 20-30 de reînsămânțări), menținând în același timp viabilitatea și nu suferă o transformare spontană.
Linii celulare continue(culturi heteroploide) sunt reprezentate de celule supuse cultivării pe termen lung și transformărilor spontane. Culturile sunt capabile de dispersie și transplant repetate. Lucrul cu ei necesită mai puțină muncă în comparație cu pregătirea culturilor primare; Celulele transplantate sunt relativ identice ca morfologie și stabile ca proprietăți.
Culturi de organe
Nu toate tipurile de celule sunt capabile să crească ca monostrat; în unele cazuri, menținerea celulelor diferențiate este posibilă numai în cultura de organe. Este de obicei o suspensie de țesut cu o funcție specializată, denumită și cultura de țesut experimentat.
Embrioni de pui (Fig. 1-20) - modele aproape ideale pentru cultivarea anumitor virusuri (de exemplu, gripa si rujeola). Cavitatea închisă a embrionului împiedică pătrunderea microorganismelor din exterior, precum și dezvoltarea infecțiilor virale spontane. Embrionii sunt utilizați pentru izolarea primară a virusurilor din material patologic; pentru trecerea și conservarea acestora, precum și pentru obținerea cantităților necesare de virus. Unii agenți patogeni (de exemplu, virusurile herpesului) provoacă modificări caracteristice (boala poate fi recunoscută de aceștia). Infecția se realizează pe membrana corion-alantoidiană, în cavitatea amniotică sau alantoică sau în sacul vitelin.
Infecția membranei corion-alantoide. De obicei se folosesc embrioni de 10-12 zile. Ouăle sunt văzute în lumină transmisă, se notează locația sacului de aer și se selectează o zonă fără vase de sânge. Îndepărtați cu grijă fragmentul de coajă, eliberați învelișul exterior și îndepărtați-l cu o presiune ușoară. Apoi se face o gaură la marginea sacului de aer. La aspirarea prin acest orificiu, membrana corion-alantoidiană este desprinsă de membrana exterioară. Materialul de testat, lipsit de bacterii și protozoare, este aplicat pe acesta (trecut prin filtre bacteriene și tratat cu bactericide).
Infecție în cavitatea amniotică.În mod obișnuit, se folosesc embrioni de 7-14 zile, în care, după desprinderea membranei corio-alantoidiane (vezi mai sus), deschiderea este extinsă, membrana amniotică este apucată cu penseta și îndepărtată prin membrana corio-alantoidiană. Prin intermediul acestuia, materialul de testat este introdus în cavitatea amniotică.
Infecție în cavitatea alantoică. Embrionii de 10 zile sunt infectați prin găurile făcute în coajă și membranele de dedesubt (vezi mai sus).
Infecție în sacul vitelin. Se folosesc embrioni de 3-8 zile, la care la această vârstă sacul vitelin ocupă aproape toată cavitatea oului. Infecția se realizează printr-o gaură făcută în sacul de aer
Observarea și înregistrarea rezultatelor. Ca material care conține virusuri, puteți utiliza conținutul sacului vitelin, lichidele alantoic și amniotic sau întregul embrion, tăiat împreună cu cel din jur.
țesături în bucăți. Pentru a identifica fig. 1-20.Ilustrare schematică
leziuni caracteristice pe corionul embrionului de pui în curs de dezvoltare.
coaja este îndepărtată de pe membrana alantoidiană
și învelișul exterior. Membrana este apoi îndepărtată și pusă în apă sterilă. Natura leziunilor este studiată pe un fundal întunecat.
Modele animale
Dacă este imposibil să izolați și să identificați virusul folosind metode standard in vitro material infecțios este administrat animalelor sensibile la agentul patogen, iar după dezvoltarea unui proces infecțios tipic, culturile de celule sensibile sunt reinfectate. Cei mai des utilizați sunt șoarecii, iepurii și maimuțele; Pentru a izola unii viruși (de exemplu, virusurile Coxsackie), șoarecii care alăptează sunt infectați. Datorită costului ridicat și complexității deținerii animalelor de laborator, acestea au fost înlocuite aproape peste tot cu culturi celulare. Cu toate acestea, modelele animale sunt utilizate în mod activ pentru a studia caracteristicile patogenezei și formarea răspunsurilor imune în timpul infecțiilor virale.
Citeste si:
|
Mulți virusuri care infectează oamenii și animalele se pot multiplica într-o măsură mai mare sau mai mică în embrionul de pui. Prezența unei învelișuri dense protejează embrionul de microorganismele din mediul extern.
Metoda de cultivare a virusurilor la embrioni de pui este utilizată în diagnosticul de laborator al infecțiilor virale, precum și pentru producerea de vaccinuri virale și medicamente de diagnostic. Dar această metodă are dezavantaje: 1) este imposibil de observat în dinamică modificările patologice care apar la embrion după infectarea cu virusul; 2) la deschiderea unui embrion infectat cu un virus, adesea nu sunt detectate modificări vizibile și este necesară detectarea prezenței virusului în țesuturile și fluidele embrionului folosind alte metode virologice (de exemplu, reacția de hemaglutinare); 3) metoda de cultivare la embrioni de pui nu este potrivită pentru toți virusurile. În ciuda dezavantajelor existente, metoda este relativ simplă, convenabilă și ieftină și este utilizată pe scară largă în studiile virologice. Este cel mai important atunci când lucrați cu ortomixovirusuri, herpesvirusuri și poxvirusuri.
1.3.1. Structura unui embrion de pui
Embrionul de pui este acoperit cu o coajă calcaroasă - o coajă, la care membrana coajă este adiacentă din interior. La capătul contondent al oului se bifurcă și conține un spațiu de aer. Sub membrana cochiliei se află o membrană corioalantoică; la capătul contondent al oului se desfășoară de-a lungul părții interioare a membranei cochiliei, înglobând spațiul aerian; această membrană este bogată în vase de sânge și servește ca organ respirator pentru embrion. Adiacent acestuia din interior se află cavitatea alantoidiană, care este un organ excretor și protejează embrionul de uscare și rănire. Cavitatea alantoidiană înconjoară embrionul situat în cavitatea amnionică, care este umplută cu lichid amniotic. Prin cordonul vitelin, embrionul este conectat la sacul vitelin, principala sursă de nutrienți.
Pentru cultivarea cu succes a virusurilor în organismul embrionilor de pui în curs de dezvoltare, este necesar un anumit regim de temperatură (36 0 -38 0), umiditate (50-70%), precum și o ventilație suficientă. Embrionii de pui de o anumită vârstă sunt infectați, incubați timp de 6 până la 13 zile, în funcție de tipul de virus și metoda de infectare. Este necesar să se pregătească: un suport de ouă, flacoane cu alcool și iod, o eprubetă cu parafină sterilă, lamele de acoperire, pungi de vată sterilă și tifon, recipiente sterile învelite în hârtie, seringi sterile, ace, pensete, ace de disecție. Instrumentele sunt plasate într-un pahar cu alcool, unde rămân pe toată durata lucrării; înainte de fiecare manipulare, sunt sterilizate suplimentar prin arderea într-o flacără a arzătorului. Mâinile se spală bine înainte de muncă; se recomandă purtarea unei mască de tifon.
Embrionii viabili sunt selectați pentru lucru prin examinarea ouălor incubate într-un ovoscop. Un embrion viabil este mobil, vasele de sânge ale membranei sunt umplute cu sânge. Ouăle selectate sunt dezinfectate temeinic la capătul contondent (sau pe partea laterală a oului): coaja este șters cu alcool, lubrifiat cu iod, retratat cu alcool și ars.
1.3.2. Infecția embrionului de pui pe membrana corioalantoidiană
Embrionii de pui de 10-12 zile sunt folosiți pentru infecție. Stadiile principale ale infecției:
1. Oul este așezat pe un suport în poziție verticală, astfel încât airbag-ul să fie în partea de sus, iar coaja este sterilizată la capătul contonat al oului.
2. Se face o puncție a cochiliei deasupra centrului sacului aerian folosind un ac de disecție.
3. Falca foarfecelor este introdusă în orificiul rezultat și se decupează o fereastră de aproximativ 1,5 cm în diametru în carcasă.
4. Prin orificiu, rupeți cu grijă frunza interioară a cochiliei cu un ac și îndepărtați-o într-o zonă mică (0,5-1 cm 2).
5. Membrana corioalantoidiană este infectată prin aplicarea a 0,1-0,2 ml de material care conţine virusuri folosind o pipetă sau o seringă Pasteur.
6. Fereastra din carcasă este acoperită cu o peliculă elastică specială sau cu o sticlă de acoperire sterilă și atașată cu parafină topită.
Embrionii infectați sunt plasați într-un termostat în poziție verticală și incubați timp de 2-3 zile, după care se efectuează o autopsie conform următoarelor reguli:
1. Oul este așezat pe un suport astfel încât spațiul de aer să fie în partea de sus, iar locul de deschidere este sterilizat.
2. Folosind foarfece sterile, tăiați carcasa de-a lungul marginii spațiului aerian.
3. Cu ajutorul unei pensete, scoateți coaja de-a lungul marginii. Membrana corioalantoidiană expusă este tăiată de-a lungul marginii cochiliei. Prin orificiul rezultat, turnați întregul conținut al ouului într-o ceașcă sau o tavă.
4. Membrana corioalantoidiană rămasă în interiorul cochiliei se îndepărtează cu grijă cu o pensetă și se pune într-o cană sterilă cu soluție salină. Aici îl îndreaptă și studiază modificările așezând cupa pe un fundal întunecat.
Pentru a obține material care conține virusul din membrana corioalantoică, acesta trebuie zdrobit cu foarfece și apoi măcinat într-un mojar cu sticlă de cuarț, adăugând o soluție salină. Suspensia rezultată este centrifugată la 2000 rpm timp de 10-15 minute și supernatantul este utilizat ca material care conține virus.
Orez. 3. Infecția embrionilor de pui
1.3.3. Infecție în cavitatea alantoică
Embrionii de 10-11 zile sunt luați pentru infecție. Stadiile principale ale infecției:
1. Oul se așează pe un suport cu capătul contondent în sus și se sterilizează coaja peste spațiul de aer.
2. Se face o puncție a cochiliei în centrul capătului contonat folosind un ac de disecție.
3. Se introduce în orificiu acul unei seringi care conține o diluție a virusului. Acul este avansat pe verticală cu 2-3 mm sub nivelul sacului de aer și apoi se injectează 0,1-0,2 ml de material.
4. Orificiul din carcasă este sigilat cu parafină sterilă topită.
Embrionii infectați sunt păstrați într-un termostat, de obicei, timp de 2 zile. Înainte de deschidere, ouăle se pun la frigider peste noapte la 4 0 C. Deschiderea se efectuează în următoarea ordine:
1. Oul se aseaza pe un suport astfel incat airbag-ul sa fie sus, coaja de deasupra sa este sterilizata.
2. Cu ajutorul foarfecelor, carcasa este tăiată ușor deasupra marginii spațiului aerian.
3. Îndepărtați cu grijă membrana cochiliei cu o pensetă, după care membrana corioalantoidiană este străpunsă cu o pipetă Pasteur în locul în care nu există vase, iar lichidul alantoidian este aspirat.
4. Lichidul alantoic este transferat într-o eprubetă sterilă și o parte din acesta este inoculată în bulion pentru a testa sterilitatea bacteriologică.
